| 查看: 4158 | 回复: 11 | ||||
| 本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | ||||
caizeyuan922铁杆木虫 (著名写手)
大虾
|
[求助]
Realtime PCR 内参与目的基因问题
|
|||
| 虫友们好，由于近期要做Realtime PCR，相对定量目的基因的表达变化，内参选定GAPDH，但是内参和目的基因扩增程序不一样，所以不能同一个批次做，只能分开，请问怎样还有意义吗？ |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 【分子生物】EPI帖 | QPCR 问题简答 |
» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有169人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 为什么qpcr目的基因和内参跑出来的胶不一样亮
已经有3人回复
- 扩增的目的基因与预期的片段大小不一样
已经有4人回复
- 关于定量PCR做基因表达量的疑问
已经有3人回复
- 根据参考文献的的引物和条件，怎么确定目的基因的大小，是什么原因
已经有6人回复
- 我想问一下如果用三条引物同时去扩增一个目的基因。结果会怎样？
已经有8人回复
- 荧光定量PCR中，结果内参基因的CT值有，但是目的基因的CT值没有，怎么办
已经有20人回复
- RT-PCR过程中内参基因CT值问题
已经有6人回复
- 关于半定量PCR的内参调节问题
已经有13人回复
- 请问一下关于real-time PCR的问题
已经有6人回复
- 内参基因筛选的问题
已经有7人回复
- 半定量PCR内参
已经有3人回复
- 没有内参基因，还能做RT-PCR吗
已经有8人回复
- RT-PCR （SYBER GREEN 染料法）内参CT值偏低
已经有7人回复
- 关于一对引物同时扩增多个不同基因的问题
已经有10人回复
- 已经得到目的基因的全长，现在要PCR将目的基因全长P出来，如何设计引物？谢谢
已经有12人回复
- miRNA做实时定量的内参基因
已经有8人回复
- real-time PCR 相对定量时 找不到内参基因 是不是就没法做？
已经有4人回复
- PCR引物必须与目的基因片段的一小段序列互补吗？急！！！
已经有9人回复
- 荧光定量pcr,以及内参基因的选择。
已经有4人回复
- 关于qRT-PCR内参基因的验证
已经有10人回复
- QPCR之 扩增效率
已经有8人回复
- realtime PCR 两个引物出现两个平台期何解？
已经有4人回复
- qRTPCR内参基因是不是每次都要做
已经有10人回复
- 相对定量内参基因循环数的问题
已经有18人回复
- realtime PCR 内参问题
已经有3人回复
- 请教real time pcr问题，谢谢！
已经有10人回复
- 【求助/交流】real-time 的两个问题。
已经有5人回复
atlanticwi
金虫 (正式写手)
琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
- MolEPI: 25
- 应助: 138 (高中生)
- 金币: 141.2
- 散金: 350
- 红花: 13
- 帖子: 536
- 在线: 313.2小时
- 虫号: 1099992
- 注册: 2010-09-15
- 专业: 植物生理与生化
【答案】应助回帖
1949stone: MolEPI+1, 这不就来了 2012-09-29 07:42:40
|
嗯................... 任何说可能可以或者不可以的都是没有好好明白定量的意义 定量再怎么说也是基于PCR的程序，虽然可以拿对数扩增区域的某一点被认为是与初始模板量呈现线性相关的（2的N次方），从而靠这一点来推测初始模板的情况 PCR程序在每一个循环对于不同底物有任何扩增的差异，都会被后续的循环扩大，差异出现的越早，到达Ct值的时候这种差异就会越大，对于终点测定的RT-PCR就更为致命了。你用不同程序，怎么保证两者处于同样的扩增水平？别告诉我说只要保证扩增效率一样就行了，那两次间机器中平行如何保证？ 我们做RT-PCR都不敢用不同程序和不同批次的内参来校订样品，更不用说qPCR了 所以说用不同程序来P内参和目标，这样做出来的都是假内参，必须设计统一程序下来P内参和目标的引物来在一块板子上做PCR，就是这样，也可能出现重复率不高的状况，究其原因，是定量为极其敏感的测定工具，请注意这极其两个字。在一切条件都符合规定的情况才能做出完美的结果，否则错误的操作做出来的都是骗自己的假结果。 祝实验顺利  |
10楼2012-09-28 12:26:45
494750284
木虫 (小有名气)
- 应助: 15 (小学生)
- 金币: 3406.1
- 散金: 76
- 红花: 13
- 帖子: 256
- 在线: 153.6小时
- 虫号: 1033236
- 注册: 2010-06-01
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-09-27 14:03:38
caizeyuan922: 金币+1, ★★★★★最佳答案 2012-09-27 20:07:06
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-09-27 14:03:38
caizeyuan922: 金币+1, ★★★★★最佳答案 2012-09-27 20:07:06
|
应该不行，要求目的基因与内参基因扩增效率一致（ΔE小于0.1）。如果你只是想摸索一下，你分开做最多可以提供一个参考。如果想用作论文里，我觉得不严谨，毕竟仪器的误差是没有办法避免的。 我建议你摸索一下目的基因的扩增程序。没有一个PCR必须要在某一个程序下才能P出来，换了一下就不行了。 我认为，你所谓的程序不一样，最重要的应该是Tm值。至于变性、预变性、延伸的时间以满足充分反应为原则，所以问题不大。循环数更不是问题了：35~40 |
2楼2012-09-27 13:06:52
cicelyzh
铁杆木虫 (职业作家)
- MolEPI: 10
- 应助: 1662 (讲师)
- 金币: 8693.8
- 红花: 72
- 帖子: 3516
- 在线: 456小时
- 虫号: 1614001
- 注册: 2012-02-13
- 专业: 生物化学
3楼2012-09-27 13:28:44
chenguestc
木虫 (职业作家)
- MolEPI: 7
- 应助: 576 (博士)
- 贵宾: 0.4
- 金币: 4526.9
- 散金: 1639
- 红花: 176
- 帖子: 4708
- 在线: 353.5小时
- 虫号: 1337860
- 注册: 2011-07-05
- 性别: GG
- 专业: 作物分子育种
4楼2012-09-27 15:02:42
5楼2012-09-27 17:06:18
atlanticwi
金虫 (正式写手)
琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
- MolEPI: 25
- 应助: 138 (高中生)
- 金币: 141.2
- 散金: 350
- 红花: 13
- 帖子: 536
- 在线: 313.2小时
- 虫号: 1099992
- 注册: 2010-09-15
- 专业: 植物生理与生化
6楼2012-09-27 17:36:43
7楼2012-09-27 17:56:28
gwd0312
木虫 (正式写手)
“无冕之王”
- MolEPI: 5
- 应助: 131 (高中生)
- 金币: 1973.2
- 红花: 10
- 帖子: 418
- 在线: 88.3小时
- 虫号: 1067565
- 注册: 2010-08-01
- 性别: GG
- 专业: 质谱分析
8楼2012-09-27 18:19:46
chenguestc
木虫 (职业作家)
- MolEPI: 7
- 应助: 576 (博士)
- 贵宾: 0.4
- 金币: 4526.9
- 散金: 1639
- 红花: 176
- 帖子: 4708
- 在线: 353.5小时
- 虫号: 1337860
- 注册: 2011-07-05
- 性别: GG
- 专业: 作物分子育种
9楼2012-09-28 07:46:00
10