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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Realtime PCR 内参与目的基因问题
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本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看

caizeyuan922

铁杆木虫 (著名写手)

大虾

[求助] Realtime PCR 内参与目的基因问题

虫友们好，由于近期要做Realtime PCR，相对定量目的基因的表达变化，内参选定GAPDH，但是内参和目的基因扩增程序不一样，所以不能同一个批次做，只能分开，请问怎样还有意义吗？
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1楼 2012-09-27 10:42:37
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回帖置顶 ( 共有1个 )

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

1949stone: MolEPI+1, 这不就来了 2012-09-29 07:42:40
引用回帖:
9楼: Originally posted by chenguestc at 2012-09-28 07:46:00
请说明为什么不行啊？请赐教。。。。。。...

嗯...................
       任何说可能可以或者不可以的都是没有好好明白定量的意义
       定量再怎么说也是基于PCR的程序，虽然可以拿对数扩增区域的某一点被认为是与初始模板量呈现线性相关的（2的N次方），从而靠这一点来推测初始模板的情况
       PCR程序在每一个循环对于不同底物有任何扩增的差异，都会被后续的循环扩大，差异出现的越早，到达Ct值的时候这种差异就会越大，对于终点测定的RT-PCR就更为致命了。你用不同程序，怎么保证两者处于同样的扩增水平？别告诉我说只要保证扩增效率一样就行了，那两次间机器中平行如何保证？
       我们做RT-PCR都不敢用不同程序和不同批次的内参来校订样品，更不用说qPCR了
       所以说用不同程序来P内参和目标，这样做出来的都是假内参，必须设计统一程序下来P内参和目标的引物来在一块板子上做PCR，就是这样，也可能出现重复率不高的状况，究其原因，是定量为极其敏感的测定工具，请注意这极其两个字。在一切条件都符合规定的情况才能做出完美的结果，否则错误的操作做出来的都是骗自己的假结果。
       祝实验顺利
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Let God do with it as He wills
10楼2012-09-28 12:26:45
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普通回帖

494750284

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-09-27 14:03:38
caizeyuan922: 金币+1, ★★★★★最佳答案 2012-09-27 20:07:06
应该不行，要求目的基因与内参基因扩增效率一致（ΔE小于0.1）。如果你只是想摸索一下，你分开做最多可以提供一个参考。如果想用作论文里，我觉得不严谨，毕竟仪器的误差是没有办法避免的。
我建议你摸索一下目的基因的扩增程序。没有一个PCR必须要在某一个程序下才能P出来，换了一下就不行了。
我认为，你所谓的程序不一样，最重要的应该是Tm值。至于变性、预变性、延伸的时间以满足充分反应为原则，所以问题不大。循环数更不是问题了：35~40
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2楼2012-09-27 13:06:52
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-09-27 14:03:48
caizeyuan922: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-09-27 20:06:49
设计引物的时候尽量使目的基因和内参的Tm值一致。还有就是扩增片段大小要尽量一致。如果目的基因和内参的丰度相差太远，需要调节模板用量，使其尽量在相同的循环下线性扩增。
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3楼2012-09-27 13:28:44
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
caizeyuan922: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-09-27 20:06:40
我觉得可以，用内参的作用不就是为了NORMALISE你的结果吗？只需要保证两引物扩增效率都在90-110%之间，扩增循环数相同就OK啊。
2楼说的仪器的误差无法避免，因为对于实时PCR，要求做至少3个生物学重复，至少2个技术重复，因此，再做重复的时候无法避免不同批次的误差，因而，我们只能认为仪器的误差为0，或者多做重复来减少误差。
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4楼2012-09-27 15:02:42
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xw19880905

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
caizeyuan922: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-09-27 20:06:27
最好是在一个程序下跑，否则不严谨，误差太大，设计引物时就可以解决这个问题呀，两对引物的Tm值差不多就行
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5楼2012-09-27 17:06:18
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
caizeyuan922: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-09-27 20:06:17
嗯....................
       四个字：绝对不行
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Let God do with it as He wills
6楼2012-09-27 17:36:43
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和一

银虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
caizeyuan922: 金币+1, ★★★很有帮助, 谢谢你 2012-09-27 20:06:04
一起跑应该问题不大，扩增的参数设置以你的目的基因的条件为准。即便和目的基因的Tm值相差较大，内参一般也是能够耐受的，你跑一次就知道了。
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7楼2012-09-27 17:56:28
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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
caizeyuan922: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-09-27 20:05:42
一般来说，只要你按照目的基因的Tm值设置参数，对照基因也是可以跑出来的。
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持之以恒、永不放弃！
8楼2012-09-27 18:19:46
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chenguestc

木虫 (职业作家)
引用回帖:
6楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-09-27 17:36:43
嗯....................
       四个字：绝对不行

请说明为什么不行啊？请赐教。。。。。。
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9楼2012-09-28 07:46:00
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