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caizeyuan922铁杆木虫 (著名写手)
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[求助]
Realtime PCR 内参与目的基因问题
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| 虫友们好，由于近期要做Realtime PCR，相对定量目的基因的表达变化，内参选定GAPDH，但是内参和目的基因扩增程序不一样，所以不能同一个批次做，只能分开，请问怎样还有意义吗？ |
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 【分子生物】EPI帖 | QPCR 问题简答 |
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atlanticwi
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【答案】应助回帖
1949stone: MolEPI+1, 这不就来了 2012-09-29 07:42:40
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嗯................... 任何说可能可以或者不可以的都是没有好好明白定量的意义 定量再怎么说也是基于PCR的程序，虽然可以拿对数扩增区域的某一点被认为是与初始模板量呈现线性相关的（2的N次方），从而靠这一点来推测初始模板的情况 PCR程序在每一个循环对于不同底物有任何扩增的差异，都会被后续的循环扩大，差异出现的越早，到达Ct值的时候这种差异就会越大，对于终点测定的RT-PCR就更为致命了。你用不同程序，怎么保证两者处于同样的扩增水平？别告诉我说只要保证扩增效率一样就行了，那两次间机器中平行如何保证？ 我们做RT-PCR都不敢用不同程序和不同批次的内参来校订样品，更不用说qPCR了 所以说用不同程序来P内参和目标，这样做出来的都是假内参，必须设计统一程序下来P内参和目标的引物来在一块板子上做PCR，就是这样，也可能出现重复率不高的状况，究其原因，是定量为极其敏感的测定工具，请注意这极其两个字。在一切条件都符合规定的情况才能做出完美的结果，否则错误的操作做出来的都是骗自己的假结果。 祝实验顺利  |
10楼2012-09-28 12:26:45
494750284
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【答案】应助回帖
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小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-09-27 14:03:38
caizeyuan922: 金币+1, ★★★★★最佳答案 2012-09-27 20:07:06
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caizeyuan922: 金币+1, ★★★★★最佳答案 2012-09-27 20:07:06
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应该不行，要求目的基因与内参基因扩增效率一致（ΔE小于0.1）。如果你只是想摸索一下，你分开做最多可以提供一个参考。如果想用作论文里，我觉得不严谨，毕竟仪器的误差是没有办法避免的。 我建议你摸索一下目的基因的扩增程序。没有一个PCR必须要在某一个程序下才能P出来，换了一下就不行了。 我认为，你所谓的程序不一样，最重要的应该是Tm值。至于变性、预变性、延伸的时间以满足充分反应为原则，所以问题不大。循环数更不是问题了：35~40 |
2楼2012-09-27 13:06:52
cicelyzh
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7楼2012-09-27 17:56:28
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9楼2012-09-28 07:46:00
