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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于qRT-PCR内参基因的验证
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wxl007777

铁杆木虫 (正式写手)

[求助] 关于qRT-PCR内参基因的验证

看了很多的文献，都是选择总量一定的Total RNA，反转录之后，检测不同处理下，不同内参基因的表达情况，从而选择合适的内参基因。

我的疑问是：假设我选择的内参基因在不同处理下表达量一致，但是肯定有其他基因表达量是不一致的，也就是说内参基因占所有基因表达量的比例不一样，那即使取等量的Total RNA进行比较，又有什么意思呢？
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1楼 2013-04-22 23:12:47
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wxl007777: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-04-23 09:42:46
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天 2013-04-23 12:26:44
你要检测的是mRNA的水平，mRNA占总RNA里的百分比很低，总RNA主要是rRNA。即使有些基因的mRNA改变，对总RNA的影响很小。
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2楼2013-04-23 01:57:21
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普通回帖

wxl007777

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-23 01:57:21
你要检测的是mRNA的水平，mRNA占总RNA里的百分比很低，总RNA主要是rRNA。即使有些基因的mRNA改变，对总RNA的影响很小。

那是否要求在反转录的时候，必须使用随机引物，而不能使用Oligo(dT)的引物？
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3楼2013-04-23 09:43:27
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by wxl007777 at 2013-04-23 09:43:27
那是否要求在反转录的时候，必须使用随机引物，而不能使用Oligo(dT)的引物？...

如果是真核生物的话，随机引物或者oligodT都可以的，一般选用oligodT。原核生物只能用随机引物。
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4楼2013-04-23 14:30:03
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wxl007777

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-23 14:30:03
如果是真核生物的话，随机引物或者oligodT都可以的，一般选用oligodT。原核生物只能用随机引物。...

啊？这是为什么？我做的真核的，如果要做18s rRNA的话，能用Oligo(dT)的引物么？
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5楼2013-04-23 15:33:19
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

哦，如果做rRNA基因的话，要用随机引物。oligodT用于反转录mRNA。有些公司的反转录盒子把随机引物和oligodT混起来使用，就没有问题的。
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6楼2013-04-24 03:45:09
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jwucn

至尊木虫 (文坛精英)
..........................帮您顶一个...................................
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7楼2013-04-24 07:22:43
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gyf608

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这个其实跟算法有关吧。一般内参的表达水平都是基本肯定的，都是一些housekeeping gene。
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8楼2013-04-24 09:49:40
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wxl007777

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-24 03:45:09
哦，如果做rRNA基因的话，要用随机引物。oligodT用于反转录mRNA。有些公司的反转录盒子把随机引物和oligodT混起来使用，就没有问题的。

恩，我也是这么认为的~但是我用Takara的反转录试剂盒，用的是Oligo(dT)的引物，但是做了荧光定量，还是能够检测出比较高的表达，这是怎么回事呢？
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9楼2013-04-24 10:30:37
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wxl007777

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by gyf608 at 2013-04-24 09:49:40
这个其实跟算法有关吧。一般内参的表达水平都是基本肯定的，都是一些housekeeping gene。

跟什么算法有关？
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10楼2013-04-24 10:31:45
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