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尚轩舞雪

银虫 (小有名气)

[交流] 相对定量内参基因循环数的问题

请教相对定量，内参基因的问题。跑相对定量时模板的浓度要调一致吗，还有内参基因是不是在不同处理的样品中循环数相近啊，我跑了几次，发现不稀释的cDNA跑出的来循环数在15左右，而稀释后循环数在22左右，是不是相差太大了，这样我的实验数据还能用吗？
请诸位大侠赐教
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cicelyzh

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1楼 2012-12-16 16:15:42
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
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尚轩舞雪: 金币+2 2012-12-17 10:10:38
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-12-17 15:40:48
所谓内参选的就是表达量在不同处理样品中稳定的基因，当然应该是CT值很接近的。用cDNA模板做定量的时候一般是需要稀释的。如何稀释要根据内参和目的基因的表达丰度。如果你做了稀释后跑出来的CT当然比没有稀释的要大，这有什么疑问的么？问题是你稀释了多少倍呢？100倍吗？我认为跑出15CT的样品浓度高了点，CT值22应该更加理想。
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2楼2012-12-17 06:40:11
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stewart3261

铜虫 (小有名气)
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尚轩舞雪: 金币+2 2012-12-17 10:10:46
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-12-17 15:40:56
模版浓度尽量一致，事实是不调一致也是可以的！内参的作用就是消除模版不一致的影响！CT值应该是相近的。CT=15这样还是不错的。模版稀释后CT值就会变大。稀释10倍,CT值大约增大3左右。你是不是稀释了100倍？
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3楼2012-12-17 09:15:31
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尚轩舞雪

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by stewart3261 at 2012-12-17 09:15:31
模版浓度尽量一致，事实是不调一致也是可以的！内参的作用就是消除模版不一致的影响！CT值应该是相近的。CT=15这样还是不错的。模版稀释后CT值就会变大。稀释10倍,CT值大约增大3左右。你是不是稀释了100倍？

荧光定量时cDNA的模板浓度不大于100ng，所以我在实验前稀释了cDNA，稀释20倍，出来的CT值在20左右。以前的材料不稀释就会小很多
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4楼2012-12-17 10:00:55
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尚轩舞雪

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-17 06:40:11
所谓内参选的就是表达量在不同处理样品中稳定的基因，当然应该是CT值很接近的。用cDNA模板做定量的时候一般是需要稀释的。如何稀释要根据内参和目的基因的表达丰度。如果你做了稀释后跑出来的CT当然比没有稀释的要大 ...

稀释了20倍，但是前后的模板来源不同，我做的生长期，前期做时没有稀释CT为15左右，后期的稀释了发现在22左右，就是这些数据可以一起用吗，想看看基因在生长期的变化
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5楼2012-12-17 10:10:32
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-12-17 15:41:06
20倍应该也就是4-5个CT的差别。查7CT感觉有些多。我认为做定量最好是把要比较的RNA样品同时做逆转录，做的时候用master mix。否则的话逆转录的效率每次不一定相同。如果样品需要不同时间收集，可以把组织液氮冻存。绝对表达肯定是不行的，如果你比相对量的话可以试着比一下，但不保证数据的可靠性。
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6楼2012-12-17 13:13:39
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尚轩舞雪

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-17 13:13:39
20倍应该也就是4-5个CT的差别。查7CT感觉有些多。我认为做定量最好是把要比较的RNA样品同时做逆转录，做的时候用master mix。否则的话逆转录的效率每次不一定相同。如果样品需要不同时间收集，可以把组织液氮冻存。 ...

最大相差7个CT值，一般都是19个CT，这样也是差4个，那这种数据还是可以用的吧？每次测定的样品比较多，而且种子不好磨，所以不能同时做。但都是－80度保存的。
另外，有个问题一直很困扰，我要做的是植物种子中的一个基因，是随着种子的形成表达量在增加。我选取了内参基因对不同时期的种子取样提取RNA做相对定量。以花后2周（即种子还很小）时作为对照，发现其表达量成几千倍的变化。这是不是不正常，一般的基因变化都是几十倍或几倍的，我的对照选取不对，还是内参不合适？
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7楼2012-12-17 14:59:10
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-12-17 15:41:17
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7楼: Originally posted by 尚轩舞雪 at 2012-12-17 14:59:10
最大相差7个CT值，一般都是19个CT，这样也是差4个，那这种数据还是可以用的吧？每次测定的样品比较多，而且种子不好磨，所以不能同时做。但都是－80度保存的。
另外，有个问题一直很困扰，我要做的是植物种子中的 ...

你反转时用的RNA是定好的吧，如果内参表达变化小于1CT就说明内参还算是稳定。RNA变化比蛋白的变化要迅速，幅度也大，有时候可以在短时间内相差几千倍。你做的是种子成熟阶段，我觉得没什么不正常。如果你觉得所选内参可能变化，你可以多试几个house keeping基因看。
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8楼2012-12-17 15:37:38
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stewart3261

铜虫 (小有名气)
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4楼: Originally posted by 尚轩舞雪 at 2012-12-17 10:00:55
荧光定量时cDNA的模板浓度不大于100ng，所以我在实验前稀释了cDNA，稀释20倍，出来的CT值在20左右。以前的材料不稀释就会小很多...

这个你做的目的基因的CT值怎么样？如果不是太大，在30或者35有完整的扩增曲线还是可以接受的！
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9楼2012-12-18 09:10:19
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尚轩舞雪

银虫 (小有名气)
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8楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-17 15:37:38
你反转时用的RNA是定好的吧，如果内参表达变化小于1CT就说明内参还算是稳定。RNA变化比蛋白的变化要迅速，幅度也大，有时候可以在短时间内相差几千倍。你做的是种子成熟阶段，我觉得没什么不正常。如果你觉得所选内 ...

反转的RNA浓度差不多，只是以不超过反转体系的RNA量为界线的，没有完全定量。如果RNA浓度相差大会有什么影响啊？
我的内参还是稳定的，就是目的基因表达变化太大，我看过其它文章中关于这个基因的变化也没有这么，和我用内参不同，所以想表达量低的内参也是对比较目的基因表达有影响。
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10楼2012-12-18 09:37:01
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
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10楼: Originally posted by 尚轩舞雪 at 2012-12-18 09:37:01
反转的RNA浓度差不多，只是以不超过反转体系的RNA量为界线的，没有完全定量。如果RNA浓度相差大会有什么影响啊？
我的内参还是稳定的，就是目的基因表达变化太大，我看过其它文章中关于这个基因的变化也没有这么， ...

一般做反转时要用同样量的RNA，从而确保合成出来的cDNA量是可比的。而且也可以根据内参的稳定性衡量样品是否平行。如果RNA量相差太大，当然cDNA的浓度也相差较多，对做定量PCR不利。当然如果相差不是很大，再用内参做基准取相对表达也是没有问题的。其它文章做过这个基因的话是可以做参考。你确定他的处理和取样与你做的相同吗？有时候条件不一样表达相差很多的。
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11楼2012-12-18 13:49:29
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尚轩舞雪

银虫 (小有名气)
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9楼: Originally posted by stewart3261 at 2012-12-18 09:10:19
这个你做的目的基因的CT值怎么样？如果不是太大，在30或者35有完整的扩增曲线还是可以接受的！...

为什么要在30或35上有完整扩增曲线啊？我做的是发育期的基因变化，CT从16－35的变化。
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12楼2012-12-18 15:06:20
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尚轩舞雪

银虫 (小有名气)
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11楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-18 13:49:29
一般做反转时要用同样量的RNA，从而确保合成出来的cDNA量是可比的。而且也可以根据内参的稳定性衡量样品是否平行。如果RNA量相差太大，当然cDNA的浓度也相差较多，对做定量PCR不利。当然如果相差不是很大，再用内参 ...

哦，明白了，就是虽然内参可以做基准来计算目的基因的表达量，但也的在不同样本间RNA量相差不大下进行，否则会不准确，对吧。另外不定量RNA，只定量cDNA也不行，因为还有反转效率的关系是吧。
另外，我附上那个基因已发表的表达情况，没有做特殊处理，只是内参不同。这个图里我不懂它的1是指什么，怎么得来的。

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13楼2012-12-18 15:11:38
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伊依雪儿

银虫 (小有名气)
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不知道你困惑在什么地方
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14楼2012-12-18 17:45:21
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cicelyzh

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尚轩舞雪: 金币+2 2012-12-19 14:46:13
反转录后的cDNA是无法定量的。因为体系里面不仅有cDNA，还有RNA模板。
既然是相对表达，具体数字是没有多少意义的。1一般是以内参的表达为基准的。但有时候目的基因与内参的表达相差较远，就会自己另行定一个标准，1只是人为规定的，没什么意义了。
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15楼2012-12-19 08:28:24
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stewart3261

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 尚轩舞雪 at 2012-12-18 15:06:20
为什么要在30或35上有完整扩增曲线啊？我做的是发育期的基因变化，CT从16－35的变化。...

CT值太大，数据不可靠！我听过实时定量的讲座！砖家意见！
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16楼2012-12-19 09:55:39
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尚轩舞雪

银虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-19 08:28:24
反转录后的cDNA是无法定量的。因为体系里面不仅有cDNA，还有RNA模板。
既然是相对表达，具体数字是没有多少意义的。1一般是以内参的表达为基准的。但有时候目的基因与内参的表达相差较远，就会自己另行定一个标准， ...

RNA的定量懂了，学习了
以处理和对照组数据来讲，1一般是对照组的值，用 2-∆∆CT方法来计算的。所以我懂你说的以内参的表达为基准是什么意思？
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17楼2012-12-19 14:46:06
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cicelyzh

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尚轩舞雪: 金币+2 2012-12-20 08:51:20
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17楼: Originally posted by 尚轩舞雪 at 2012-12-19 14:46:06
RNA的定量懂了，学习了
以处理和对照组数据来讲，1一般是对照组的值，用 2-∆∆CT方法来计算的。所以我懂你说的以内参的表达为基准是什么意思？...

就是把内参表达量定为1，其它基因相对内参用2-ΔΔCT。
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尚轩舞雪
18楼2012-12-20 08:43:33
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尚轩舞雪

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引用回帖:
18楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-20 08:43:33
就是把内参表达量定为1，其它基因相对内参用2-ΔΔCT。...

哦，懂了，就是表述的问题，非常感谢
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19楼2012-12-20 08:51:13
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