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[求助]
相对定量测基因相对表达量，急啊！！！
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老师要求本人测定水稻抗旱相关的20多个基因的相对表达量，有四个样。太多了，而且样品有限。我没有测扩增效率，直接用双△法测表达量了。内参是用的UBQ5，一个印度人写的。现在遇到很多问题，用的是TAKARA的荧光定量试剂盒， 1、好几个基因CT值都大于35，我提高了模板浓度也不行（我没测RNA浓度，直接测cDNA浓度，然后调成与试剂盒要求的DNA的量来做）。 2、PCR反应过程都按照说明书上设置了，没改改动，循环数40个，因为不太会改。另外用primer5算出的温度，还是用Oligo6算出的温度？因为试剂盒说明书上只给出了Oligo6的温度范围。 3、我跑普通PCR的时候有时候没条带，但跑荧光的时候特异性很好。那是不是没必要跑普通PCR了呢？不过我听其他实验室人说，要先跑梯度PCR，找出最适退火温度，然后再上荧光PCR。 4、有时候有非特异性扩增，提高温度了还不行，是不是要换引物了？ 不好意思，本人新手不太懂，折腾了好几千块钱了，还没出什么结果，很是焦急。求大神指导，不胜感激！！！ |
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