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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 相对定量测基因相对表达量，急啊！！！
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宫保鸡丁YZ

银虫 (小有名气)

[求助] 相对定量测基因相对表达量，急啊！！！

老师要求本人测定水稻抗旱相关的20多个基因的相对表达量，有四个样。太多了，而且样品有限。我没有测扩增效率，直接用双△法测表达量了。内参是用的UBQ5，一个印度人写的。现在遇到很多问题，用的是TAKARA的荧光定量试剂盒，
        1、好几个基因CT值都大于35，我提高了模板浓度也不行（我没测RNA浓度，直接测cDNA浓度，然后调成与试剂盒要求的DNA的量来做）。
        2、PCR反应过程都按照说明书上设置了，没改改动，循环数40个，因为不太会改。另外用primer5算出的温度，还是用Oligo6算出的温度？因为试剂盒说明书上只给出了Oligo6的温度范围。
        3、我跑普通PCR的时候有时候没条带，但跑荧光的时候特异性很好。那是不是没必要跑普通PCR了呢？不过我听其他实验室人说，要先跑梯度PCR，找出最适退火温度，然后再上荧光PCR。
        4、有时候有非特异性扩增，提高温度了还不行，是不是要换引物了？
不好意思，本人新手不太懂，折腾了好几千块钱了，还没出什么结果，很是焦急。求大神指导，不胜感激！！！
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面包会有的，牛奶也会有的
1楼 2012-07-19 17:01:07
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xw19880905

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 宫保鸡丁YZ at 2012-07-19 20:50:02
我的内参稳定在27到28左右。我是先 在Primer5里面挑好引物，然后再用Oligo6评价的，温度都在62度以上(Oligo6里面给出的温度)，非特异性我试着提高温度都没什么效果，看来只能重新设计了。第一次发帖，第一个回复， ...

说实话，你内参确实有点长。你这些引物最好都设计在62℃左右，方便后面的实验操作
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4楼2012-07-20 09:48:28
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xw19880905

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-07-19 20:45:09
宫保鸡丁YZ: 金币+5, ★有帮助 2012-07-19 21:31:15
ct值较大说明表达量低，你内参基因表达的ct值差异大不大？如果不大就没问题。最好用oligo6来设计引物，毕竟你做的基因太多，不好改变程序，所以设计引物时最好将温度都设计在一个温度左右，产物长度约150bp左右。非特异扩增的引物我建议重新设计引物
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宫保鸡丁YZ
2楼2012-07-19 17:18:09
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宫保鸡丁YZ

银虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by xw19880905 at 2012-07-19 17:18:09
ct值较大说明表达量低，你内参基因表达的ct值差异大不大？如果不大就没问题。最好用oligo6来设计引物，毕竟你做的基因太多，不好改变程序，所以设计引物时最好将温度都设计在一个温度左右，产物长度约150bp左右。非 ...

我的内参稳定在27到28左右。我是先 在Primer5里面挑好引物，然后再用Oligo6评价的，温度都在62度以上(Oligo6里面给出的温度)，非特异性我试着提高温度都没什么效果，看来只能重新设计了。第一次发帖，第一个回复，送朵鲜花，呵呵
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面包会有的，牛奶也会有的
3楼2012-07-19 20:50:02
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宫保鸡丁YZ

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by xw19880905 at 2012-07-20 09:48:28
说实话，你内参确实有点长。你这些引物最好都设计在62℃左右，方便后面的实验操作...

内参不长啊，比18S RNA 、GAPDH什么的都短。以前师兄用的，效果挺好。
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面包会有的，牛奶也会有的
5楼2012-07-20 10:09:28
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