应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 相对定量测基因相对表达量，急啊！！！
51/1返回列表
查看: 1549  |  回复: 4
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

宫保鸡丁YZ

银虫 (小有名气)

[求助] 相对定量测基因相对表达量，急啊！！！

老师要求本人测定水稻抗旱相关的20多个基因的相对表达量，有四个样。太多了，而且样品有限。我没有测扩增效率，直接用双△法测表达量了。内参是用的UBQ5，一个印度人写的。现在遇到很多问题，用的是TAKARA的荧光定量试剂盒，
        1、好几个基因CT值都大于35，我提高了模板浓度也不行（我没测RNA浓度，直接测cDNA浓度，然后调成与试剂盒要求的DNA的量来做）。
        2、PCR反应过程都按照说明书上设置了，没改改动，循环数40个，因为不太会改。另外用primer5算出的温度，还是用Oligo6算出的温度？因为试剂盒说明书上只给出了Oligo6的温度范围。
        3、我跑普通PCR的时候有时候没条带，但跑荧光的时候特异性很好。那是不是没必要跑普通PCR了呢？不过我听其他实验室人说，要先跑梯度PCR，找出最适退火温度，然后再上荧光PCR。
        4、有时候有非特异性扩增，提高温度了还不行，是不是要换引物了？
不好意思，本人新手不太懂，折腾了好几千块钱了，还没出什么结果，很是焦急。求大神指导，不胜感激！！！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
面包会有的，牛奶也会有的
1楼 2012-07-19 17:01:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

宫保鸡丁YZ

银虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by xw19880905 at 2012-07-19 17:18:09
ct值较大说明表达量低，你内参基因表达的ct值差异大不大？如果不大就没问题。最好用oligo6来设计引物，毕竟你做的基因太多，不好改变程序，所以设计引物时最好将温度都设计在一个温度左右，产物长度约150bp左右。非 ...

我的内参稳定在27到28左右。我是先 在Primer5里面挑好引物，然后再用Oligo6评价的，温度都在62度以上(Oligo6里面给出的温度)，非特异性我试着提高温度都没什么效果，看来只能重新设计了。第一次发帖，第一个回复，送朵鲜花，呵呵
赞一下 回复此楼
面包会有的，牛奶也会有的
3楼2012-07-19 20:50:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 5 个回答

xw19880905

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-07-19 20:45:09
宫保鸡丁YZ: 金币+5, ★有帮助 2012-07-19 21:31:15
ct值较大说明表达量低，你内参基因表达的ct值差异大不大？如果不大就没问题。最好用oligo6来设计引物，毕竟你做的基因太多，不好改变程序，所以设计引物时最好将温度都设计在一个温度左右，产物长度约150bp左右。非特异扩增的引物我建议重新设计引物
赞一下(1人) 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

宫保鸡丁YZ
2楼2012-07-19 17:18:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xw19880905

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 宫保鸡丁YZ at 2012-07-19 20:50:02
我的内参稳定在27到28左右。我是先 在Primer5里面挑好引物，然后再用Oligo6评价的，温度都在62度以上(Oligo6里面给出的温度)，非特异性我试着提高温度都没什么效果，看来只能重新设计了。第一次发帖，第一个回复， ...

说实话，你内参确实有点长。你这些引物最好都设计在62℃左右，方便后面的实验操作
赞一下 回复此楼
4楼2012-07-20 09:48:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

宫保鸡丁YZ

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by xw19880905 at 2012-07-20 09:48:28
说实话，你内参确实有点长。你这些引物最好都设计在62℃左右，方便后面的实验操作...

内参不长啊，比18S RNA 、GAPDH什么的都短。以前师兄用的，效果挺好。
赞一下 回复此楼
面包会有的，牛奶也会有的
5楼2012-07-20 10:09:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 5 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿天大材料与化工（085600）总分338 +4 蔡大美女 2026-03-13 4/200 2026-03-18 22:47 by walc
[考研] 能源材料化学课题组招收硕士研究生8-10名 +4 脱颖而出 2026-03-16 10/500 2026-03-18 20:59 by 脱颖而出
[考研] 267一志愿南京工业大学0817化工求调剂 +8 SUICHILD 2026-03-12 8/400 2026-03-18 20:55 by winsuccess
[考研] 08工科 320总分 求调剂 +5 梨花珞晚风 2026-03-17 5/250 2026-03-18 14:49 by haxia
[考研] 0854可跨调剂，一作一项核心论文五项专利，省、国级证书40+数一英一287 +8 小李0854 2026-03-16 8/400 2026-03-18 14:35 by 搏击518
[考研] 085601材料工程专硕求调剂 +6 慕寒mio 2026-03-16 6/300 2026-03-18 14:26 by 007_lilei
[考研] 一志愿西南交大，求调剂 +4 材化逐梦人 2026-03-18 4/200 2026-03-18 14:22 by 007_lilei
[考研] 收复试调剂生 +4 雨后秋荷 2026-03-18 4/200 2026-03-18 14:16 by elevennnne
[考博] 环境领域全国重点实验室招收博士1-2名 +3 QGZDSYS 2026-03-13 5/250 2026-03-18 11:13 by QGZDSYS
[考研] 293求调剂 +11 zjl的号 2026-03-16 16/800 2026-03-18 08:10 by zhukairuo
[考研] 326求调剂 +5 上岸的小葡 2026-03-15 6/300 2026-03-17 17:26 by ruiyingmiao
[硕博家园] 湖北工业大学 生命科学与健康学院-课题组招收2026级食品/生物方向硕士 +3 1喜春8 2026-03-17 5/250 2026-03-17 17:18 by ber川cool子
[论文投稿] 有没有大佬发小论文能带我个二作 +3 增锐漏人 2026-03-17 4/200 2026-03-17 09:26 by xs74101122
[考研] 085600调剂 +5 漾漾123sun 2026-03-12 6/300 2026-03-16 15:58 by 漾漾123sun
[基金申请] 现在如何回避去年的某一个专家，不知道名字 +3 zk200107 2026-03-12 6/300 2026-03-14 17:13 by zk200107
[考研] ［0860］321分求调剂，ab区皆可 +4 宝贵热 2026-03-13 4/200 2026-03-13 22:01 by 星空星月
[考研] 329求调剂 +3 miaodesi 2026-03-12 4/200 2026-03-13 20:53 by 18595523086
[硕博家园] 085600 260分求调剂 +3 天空还下雨么 2026-03-13 5/250 2026-03-13 18:46 by 天空还下雨么
[考研] 求调剂 +5 一定有学上- 2026-03-12 5/250 2026-03-13 18:31 by ms629
[考研] 333求调剂 +3 152697 2026-03-12 4/200 2026-03-13 07:08 by Iveryant
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭