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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 相对定量内参基因循环数的问题
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尚轩舞雪

银虫 (小有名气)

[交流] 相对定量内参基因循环数的问题

请教相对定量，内参基因的问题。跑相对定量时模板的浓度要调一致吗，还有内参基因是不是在不同处理的样品中循环数相近啊，我跑了几次，发现不稀释的cDNA跑出的来循环数在15左右，而稀释后循环数在22左右，是不是相差太大了，这样我的实验数据还能用吗？
请诸位大侠赐教
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cicelyzh

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1楼 2012-12-16 16:15:42
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尚轩舞雪

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-17 13:13:39
20倍应该也就是4-5个CT的差别。查7CT感觉有些多。我认为做定量最好是把要比较的RNA样品同时做逆转录，做的时候用master mix。否则的话逆转录的效率每次不一定相同。如果样品需要不同时间收集，可以把组织液氮冻存。 ...

最大相差7个CT值，一般都是19个CT，这样也是差4个，那这种数据还是可以用的吧？每次测定的样品比较多，而且种子不好磨，所以不能同时做。但都是－80度保存的。
另外，有个问题一直很困扰，我要做的是植物种子中的一个基因，是随着种子的形成表达量在增加。我选取了内参基因对不同时期的种子取样提取RNA做相对定量。以花后2周（即种子还很小）时作为对照，发现其表达量成几千倍的变化。这是不是不正常，一般的基因变化都是几十倍或几倍的，我的对照选取不对，还是内参不合适？
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7楼2012-12-17 14:59:10
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
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尚轩舞雪: 金币+2 2012-12-17 10:10:38
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-12-17 15:40:48
所谓内参选的就是表达量在不同处理样品中稳定的基因，当然应该是CT值很接近的。用cDNA模板做定量的时候一般是需要稀释的。如何稀释要根据内参和目的基因的表达丰度。如果你做了稀释后跑出来的CT当然比没有稀释的要大，这有什么疑问的么？问题是你稀释了多少倍呢？100倍吗？我认为跑出15CT的样品浓度高了点，CT值22应该更加理想。
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2楼2012-12-17 06:40:11
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stewart3261

铜虫 (小有名气)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
尚轩舞雪: 金币+2 2012-12-17 10:10:46
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-12-17 15:40:56
模版浓度尽量一致，事实是不调一致也是可以的！内参的作用就是消除模版不一致的影响！CT值应该是相近的。CT=15这样还是不错的。模版稀释后CT值就会变大。稀释10倍,CT值大约增大3左右。你是不是稀释了100倍？
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3楼2012-12-17 09:15:31
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尚轩舞雪

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by stewart3261 at 2012-12-17 09:15:31
模版浓度尽量一致，事实是不调一致也是可以的！内参的作用就是消除模版不一致的影响！CT值应该是相近的。CT=15这样还是不错的。模版稀释后CT值就会变大。稀释10倍,CT值大约增大3左右。你是不是稀释了100倍？

荧光定量时cDNA的模板浓度不大于100ng，所以我在实验前稀释了cDNA，稀释20倍，出来的CT值在20左右。以前的材料不稀释就会小很多
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4楼2012-12-17 10:00:55
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