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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 相对定量内参基因循环数的问题
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尚轩舞雪

银虫 (小有名气)

[交流] 相对定量内参基因循环数的问题

请教相对定量，内参基因的问题。跑相对定量时模板的浓度要调一致吗，还有内参基因是不是在不同处理的样品中循环数相近啊，我跑了几次，发现不稀释的cDNA跑出的来循环数在15左右，而稀释后循环数在22左右，是不是相差太大了，这样我的实验数据还能用吗？
请诸位大侠赐教
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cicelyzh

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1楼 2012-12-16 16:15:42
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尚轩舞雪

银虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-18 13:49:29
一般做反转时要用同样量的RNA，从而确保合成出来的cDNA量是可比的。而且也可以根据内参的稳定性衡量样品是否平行。如果RNA量相差太大，当然cDNA的浓度也相差较多，对做定量PCR不利。当然如果相差不是很大，再用内参 ...

哦，明白了，就是虽然内参可以做基准来计算目的基因的表达量，但也的在不同样本间RNA量相差不大下进行，否则会不准确，对吧。另外不定量RNA，只定量cDNA也不行，因为还有反转效率的关系是吧。
另外，我附上那个基因已发表的表达情况，没有做特殊处理，只是内参不同。这个图里我不懂它的1是指什么，怎么得来的。

1.JPG
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13楼2012-12-18 15:11:38
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
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尚轩舞雪: 金币+2 2012-12-17 10:10:38
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-12-17 15:40:48
所谓内参选的就是表达量在不同处理样品中稳定的基因，当然应该是CT值很接近的。用cDNA模板做定量的时候一般是需要稀释的。如何稀释要根据内参和目的基因的表达丰度。如果你做了稀释后跑出来的CT当然比没有稀释的要大，这有什么疑问的么？问题是你稀释了多少倍呢？100倍吗？我认为跑出15CT的样品浓度高了点，CT值22应该更加理想。
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2楼2012-12-17 06:40:11
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stewart3261

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
尚轩舞雪: 金币+2 2012-12-17 10:10:46
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-12-17 15:40:56
模版浓度尽量一致，事实是不调一致也是可以的！内参的作用就是消除模版不一致的影响！CT值应该是相近的。CT=15这样还是不错的。模版稀释后CT值就会变大。稀释10倍,CT值大约增大3左右。你是不是稀释了100倍？
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3楼2012-12-17 09:15:31
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尚轩舞雪

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by stewart3261 at 2012-12-17 09:15:31
模版浓度尽量一致，事实是不调一致也是可以的！内参的作用就是消除模版不一致的影响！CT值应该是相近的。CT=15这样还是不错的。模版稀释后CT值就会变大。稀释10倍,CT值大约增大3左右。你是不是稀释了100倍？

荧光定量时cDNA的模板浓度不大于100ng，所以我在实验前稀释了cDNA，稀释20倍，出来的CT值在20左右。以前的材料不稀释就会小很多
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4楼2012-12-17 10:00:55
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