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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 荧光定量PCR中，结果内参基因的CT值有，但是目的基因的CT值没有，怎么办
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andyffcc

银虫 (初入文坛)

[求助] 荧光定量PCR中，结果内参基因的CT值有，但是目的基因的CT值没有，怎么办 已有5人参与

请教各位，最近在做qRT-PCR，内参选的是18s，结果发现，内参的CT值有，但是目的基因的CT值没有。PCR程序的循环是34，内参的CT值到20几了，最高都达到30了，好像高了点，因为之前做的都只有十几左右，目的基因的CT值干脆就没了，是不是模板的浓度太低了，（ps：我的反转录产物是稀释过再用的），是不是通过增加模板量就可以，还是有没有其他有问题的地方呢，请各位指教一下，谢谢！
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1楼 2014-06-08 22:52:20
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曼舞流苏

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-06-09 11:17:29
增加模板量只会使得Ct值更加小，我第一次做时候Ct值特别小，大都只有9左右，后来降低了模板浓度，Ct值基本上在20左右，还算是比较理想（理想Ct值应该15-30之间，20最好），你的这种情况估计是RNA没有取出来，或者是收到了污染（过程中管污染和八联管），或者是提取过程中RNA降解，或者是像八联管中加样加错等，自己查找一下原因。
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2楼2014-06-09 09:05:15
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andyffcc

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 曼舞流苏 at 2014-06-09 09:05:15
增加模板量只会使得Ct值更加小，我第一次做时候Ct值特别小，大都只有9左右，后来降低了模板浓度，Ct值基本上在20左右，还算是比较理想（理想Ct值应该15-30之间，20最好），你的这种情况估计是RNA没有取出来，或者是 ...

你好，谢谢指教。
我一共做了三个目的基因，就唯独其中一个没有，都是同一96孔板上的，有没有可能是那个目的基因还没检测到，PCR反应就已经结束了，所以只有内参的CT值有。因此我想是不是那个基因的表达太低了还是模板浓度太低了。谢谢
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3楼2014-06-09 10:33:39
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若溪

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
个人觉得有可能是cDNA模板有点低，因为以18S为内参，一般Ct值都挺靠前的，13左右，你的都达到20几了，另外也不排除你的荧光染料是否加的太多或本身这个基因的表达量就比较低的可能，荧光染料加的过多也会影响Ct值，我们做实验一般设置40个循环，所以你改变起始cDNA浓度后，仍检测不到目的基因的Ct值，建议增加循环数试一试
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没有比脚更长的路，没有比人更高的山
4楼2014-06-09 11:56:00
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andyffcc

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 若溪 at 2014-06-09 11:56:00
个人觉得有可能是cDNA模板有点低，因为以18S为内参，一般Ct值都挺靠前的，13左右，你的都达到20几了，另外也不排除你的荧光染料是否加的太多或本身这个基因的表达量就比较低的可能，荧光染料加的过多也会影响Ct值， ...

谢谢，我增加浓度试试
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5楼2014-06-09 12:29:50
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曼舞流苏

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
3楼: Originally posted by andyffcc at 2014-06-09 10:33:39
你好，谢谢指教。
我一共做了三个目的基因，就唯独其中一个没有，都是同一96孔板上的，有没有可能是那个目的基因还没检测到，PCR反应就已经结束了，所以只有内参的CT值有。因此我想是不是那个基因的表达太低了还是 ...

还有可能是引物设计不合理，我有一次做的也是目的基因压根就没有表达，可以考虑换引物试试。
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6楼2014-06-10 08:21:29
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necrosis

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 曼舞流苏 at 2014-06-10 08:21:29
还有可能是引物设计不合理，我有一次做的也是目的基因压根就没有表达，可以考虑换引物试试。...

你好，请问你是如何判断目的基因没有表达？和阴性对照对比吗？
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7楼2015-02-13 13:47:15
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曼舞流苏

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

建议，增加模板浓度和增加循环数。。。。。另外你可以配合溶解曲线和跑胶来分析目的基因是否表达。。。。
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8楼2015-03-10 15:07:12
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by小宁

木虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 曼舞流苏 at 2014-06-09 09:05:15
增加模板量只会使得Ct值更加小，我第一次做时候Ct值特别小，大都只有9左右，后来降低了模板浓度，Ct值基本上在20左右，还算是比较理想（理想Ct值应该15-30之间，20最好），你的这种情况估计是RNA没有取出来，或者是 ...

亲  你模板浓度降低了多少啊？我的内参基因CT值在9左右 但是目的基因CT值在30左右  再降低模板浓度的话 目的基因的CT值都该超了35了 我该怎么办呢？内参的引物也换了好多了  内参引物CT值高的高 低的低  就是没有能用的
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9楼2015-07-08 14:31:49
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曼舞流苏

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by by小宁 at 2015-07-08 14:31:49
亲  你模板浓度降低了多少啊？我的内参基因CT值在9左右 但是目的基因CT值在30左右  再降低模板浓度的话 目的基因的CT值都该超了35了 我该怎么办呢？内参的引物也换了好多了  内参引物CT值高的高 低的低  就是没有能 ...

按照你提取出RNA后用多少DEPC水溶解的计算，可以适当增加溶解水用量，想要更精确一点的话可以再测个吸光度计算一下RNA浓度。你的内参Ct在9左右，目的基金30左右，说明你目的基因的表达量太低了，你考虑重新换内参引物序列吧，或者换一个看家基因试试。
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10楼2015-07-09 10:23:01
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