应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 荧光定量PCR中，结果内参基因的CT值有，但是目的基因的CT值没有，怎么办
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
211/3返回列表123下一页
查看: 15733  |  回复: 20
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

andyffcc

银虫 (初入文坛)

[求助] 荧光定量PCR中，结果内参基因的CT值有，但是目的基因的CT值没有，怎么办 已有5人参与

请教各位，最近在做qRT-PCR，内参选的是18s，结果发现，内参的CT值有，但是目的基因的CT值没有。PCR程序的循环是34，内参的CT值到20几了，最高都达到30了，好像高了点，因为之前做的都只有十几左右，目的基因的CT值干脆就没了，是不是模板的浓度太低了，（ps：我的反转录产物是稀释过再用的），是不是通过增加模板量就可以，还是有没有其他有问题的地方呢，请各位指教一下，谢谢！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-06-08 22:52:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

曼舞流苏

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-06-09 11:17:29
增加模板量只会使得Ct值更加小，我第一次做时候Ct值特别小，大都只有9左右，后来降低了模板浓度，Ct值基本上在20左右，还算是比较理想（理想Ct值应该15-30之间，20最好），你的这种情况估计是RNA没有取出来，或者是收到了污染（过程中管污染和八联管），或者是提取过程中RNA降解，或者是像八联管中加样加错等，自己查找一下原因。
赞一下 回复此楼
2楼2014-06-09 09:05:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

andyffcc

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 曼舞流苏 at 2014-06-09 09:05:15
增加模板量只会使得Ct值更加小，我第一次做时候Ct值特别小，大都只有9左右，后来降低了模板浓度，Ct值基本上在20左右，还算是比较理想（理想Ct值应该15-30之间，20最好），你的这种情况估计是RNA没有取出来，或者是 ...

你好，谢谢指教。
我一共做了三个目的基因，就唯独其中一个没有，都是同一96孔板上的，有没有可能是那个目的基因还没检测到，PCR反应就已经结束了，所以只有内参的CT值有。因此我想是不是那个基因的表达太低了还是模板浓度太低了。谢谢
赞一下 回复此楼
3楼2014-06-09 10:33:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

若溪

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
个人觉得有可能是cDNA模板有点低，因为以18S为内参，一般Ct值都挺靠前的，13左右，你的都达到20几了，另外也不排除你的荧光染料是否加的太多或本身这个基因的表达量就比较低的可能，荧光染料加的过多也会影响Ct值，我们做实验一般设置40个循环，所以你改变起始cDNA浓度后，仍检测不到目的基因的Ct值，建议增加循环数试一试
赞一下 回复此楼
没有比脚更长的路，没有比人更高的山
4楼2014-06-09 11:56:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

andyffcc

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 若溪 at 2014-06-09 11:56:00
个人觉得有可能是cDNA模板有点低，因为以18S为内参，一般Ct值都挺靠前的，13左右，你的都达到20几了，另外也不排除你的荧光染料是否加的太多或本身这个基因的表达量就比较低的可能，荧光染料加的过多也会影响Ct值， ...

谢谢，我增加浓度试试
赞一下 回复此楼
5楼2014-06-09 12:29:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

曼舞流苏

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
3楼: Originally posted by andyffcc at 2014-06-09 10:33:39
你好，谢谢指教。
我一共做了三个目的基因，就唯独其中一个没有，都是同一96孔板上的，有没有可能是那个目的基因还没检测到，PCR反应就已经结束了，所以只有内参的CT值有。因此我想是不是那个基因的表达太低了还是 ...

还有可能是引物设计不合理，我有一次做的也是目的基因压根就没有表达，可以考虑换引物试试。
赞一下 回复此楼
6楼2014-06-10 08:21:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

necrosis

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 曼舞流苏 at 2014-06-10 08:21:29
还有可能是引物设计不合理，我有一次做的也是目的基因压根就没有表达，可以考虑换引物试试。...

你好，请问你是如何判断目的基因没有表达？和阴性对照对比吗？
赞一下 回复此楼
7楼2015-02-13 13:47:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

曼舞流苏

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

建议，增加模板浓度和增加循环数。。。。。另外你可以配合溶解曲线和跑胶来分析目的基因是否表达。。。。
赞一下 回复此楼
8楼2015-03-10 15:07:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

by小宁

木虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 曼舞流苏 at 2014-06-09 09:05:15
增加模板量只会使得Ct值更加小，我第一次做时候Ct值特别小，大都只有9左右，后来降低了模板浓度，Ct值基本上在20左右，还算是比较理想（理想Ct值应该15-30之间，20最好），你的这种情况估计是RNA没有取出来，或者是 ...

亲  你模板浓度降低了多少啊？我的内参基因CT值在9左右 但是目的基因CT值在30左右  再降低模板浓度的话 目的基因的CT值都该超了35了 我该怎么办呢？内参的引物也换了好多了  内参引物CT值高的高 低的低  就是没有能用的
赞一下 回复此楼
9楼2015-07-08 14:31:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

曼舞流苏

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by by小宁 at 2015-07-08 14:31:49
亲  你模板浓度降低了多少啊？我的内参基因CT值在9左右 但是目的基因CT值在30左右  再降低模板浓度的话 目的基因的CT值都该超了35了 我该怎么办呢？内参的引物也换了好多了  内参引物CT值高的高 低的低  就是没有能 ...

按照你提取出RNA后用多少DEPC水溶解的计算，可以适当增加溶解水用量，想要更精确一点的话可以再测个吸光度计算一下RNA浓度。你的内参Ct在9左右，目的基金30左右，说明你目的基因的表达量太低了，你考虑重新换内参引物序列吧，或者换一个看家基因试试。
赞一下 回复此楼
10楼2015-07-09 10:23:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 andyffcc 的主题更新
211/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 08专硕275调剂 +5 AaAa7420 2026-04-05 5/250 2026-04-05 18:01 by jkddd
[考研] 292分，材料与化工，申请调剂 +22 程晴之 2026-04-01 26/1300 2026-04-04 22:03 by hemengdong
[考研] 求调剂 +4 晟功? 2026-04-03 4/200 2026-04-04 21:58 by hemengdong
[考研] 357求调剂 +13 1050389037 2026-04-03 13/650 2026-04-03 22:27 by 无际的草原
[考研] 085601一志愿北理325分求调剂 +6 找调剂，， 2026-04-02 6/300 2026-04-03 22:20 by 柟�?
[考研] 一志愿华中农业071010，总分320求调剂 +7 困困困困坤坤 2026-04-02 7/350 2026-04-03 17:26 by Yuena_Wang
[考研] 数一英一285求调剂 +7 AZMK 2026-04-03 9/450 2026-04-03 13:03 by ms629
[考研] 285求调剂 +7 AZMK 2026-04-02 9/450 2026-04-03 11:12 by wanwan00
[考研] 一志愿中国科学院大学265求调剂 +9 恬淡ye 2026-03-31 10/500 2026-04-03 11:10 by txp1986
[考研] 调剂 +7 祉岷. 2026-04-02 7/350 2026-04-03 09:11 by 花呗还欠600
[考研] 调剂 +3 osbbx 2026-04-02 3/150 2026-04-03 07:47 by cc8418
[考研] 一志愿上海海洋大学083200食品学硕，求调剂，接受其他专业 +6 what张 2026-04-01 7/350 2026-04-02 16:48 by zzsw+
[考研] 初试301，代码085701环境工程，本硕一致，四六级已过，有二区一作，共发表5篇论文 +6 axibli 2026-04-01 6/300 2026-04-02 13:42 by Ecowxq666！
[考研] 270调剂 +7 maxjxbsk 2026-04-02 7/350 2026-04-02 09:50 by yulian1987
[考研] 304求调剂 +12 素年祭语 2026-03-31 15/750 2026-04-01 22:41 by peike
[考研] 292求调剂 +17 木虫er12138 2026-04-01 17/850 2026-04-01 21:37 by 七度不信任
[考研] 考研材料工程351分调剂 +5 整个好的 2026-03-31 5/250 2026-04-01 09:36 by topgun2009
[考研] 调剂申请 +8 张张张张zy 2026-03-31 9/450 2026-04-01 08:29 by zjbkx
[考研] 复试调剂 +7 双马尾痞老板2 2026-03-31 7/350 2026-03-31 19:49 by Dyhoer
[考研] 262求调剂 +7 ZZ..000 2026-03-30 8/400 2026-03-31 10:05 by cal0306
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭