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963979587

银虫 (初入文坛)

[求助] 实时荧光定量pcr，cDNA的加入量会影响结果的准确度吗？

大家好，最近一直做荧光定量pcr，20ul体系中3ug的rna反转录得到的cDNA，取4ul作为pcr的模板，10ul EvaGreen，4ul引物，2ulRNas水，这个体系可以得到挺好的结果，但是溶解曲线的温度在77°，不知道是不是引物二聚体，而且我觉得模板的量加的太多了，实验不能重复，一次就用光了，不知道是不是应该稀释一下？
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1楼 2013-10-14 15:54:30
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

asr

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-15 10:27:28
20ul体系中3ug的rna反转录得到的cDNA，取4ul作为pcr的模板  

量明显太高了，先摸摸条件呀
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思想极度邪恶，勿怕勿怪！\(^o^)/~
3楼2013-10-14 23:29:42
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taccycle

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1、把cDNA稀释10倍的话其Ct值才增大3.2左右，只要你的Ct最后能落在33以内机器检测的准确度就没有什么影响，所以只要你目的基因的Ct值在30以内，你就可以大胆放心的稀释，你可以先稀释5倍测试一下。
2、检测有没有引物二聚体你可以配一个3%的琼脂糖胶把PCR产物跑一个电泳，选择一个合适的Marker，比如DL500，引物二聚体一般都小于100bp，如果只有一条size正确的条带，那就说明没有引物二聚体
3、Tm值不能说明这个峰是不是引物二聚体，我的目的条带的Tm有的只有75℃
4、模板用量不会影响定量结果（只要不是那种极端用量），这是理论上决定的，就算有影响也是微乎其微的
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用心
13楼2013-10-16 16:24:57
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-15 10:27:19
你的模板用量不是一般的大。通常情况下是用1μg RNA反转录后稀释5倍后取1μl做模板。把熔解曲线图发上来看看。CT值是多少？是否在15-30之间？
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2楼2013-10-14 22:31:01
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963979587

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-10-14 22:31:01
你的模板用量不是一般的大。通常情况下是用1μg RNA反转录后稀释5倍后取1μl做模板。把熔解曲线图发上来看看。CT值是多少？是否在15-30之间？

目的基因VCAM的CT值在25个循环左右，GAPDH在19个循环这儿，基本上都有平台期，
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4楼2013-10-15 10:20:26
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asr

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 963979587 at 2013-10-15 10:22:46
我们实验室就我自己做，都不知道从哪儿开始摸条件，我在想会不会是我提的rna质量不好造成的，OD260/OD230都在1以下，OD260/OD280还可以，不知道这样会不会影响反转录的效果？...

OD260/OD230都在1以下 这个说明什么？

你的RNA浓度是多少？ 一般反转录要求的模板量试剂盒会有要求的。
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6楼2013-10-15 15:51:55
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 963979587 at 2013-10-15 10:20:26
目的基因VCAM的CT值在25个循环左右，GAPDH在19个循环这儿，基本上都有平台期，...

循环数目还可以。把熔解曲线发上来看看你说的Tm问题吧，一般正常产物的熔解温度在80°C以上的。
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8楼2013-10-15 22:12:45
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asr

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 963979587 at 2013-10-15 22:01:58
rna浓度是500ng/ul,OD值在1以下好像是有胍盐的污染，或者是乙醇没处理干净，反转录的试剂是按要求来的，但是cDNA的浓度我没办法确定，看着说明书好像是几十ng，但是我还能按我的那个模板量跑出平台期就觉得比较奇怪 ...

你可以将模板稀释不同的倍数来确定那个浓度合适。不同的材料 浓度有所不同。
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9楼2013-10-16 00:29:32
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asr

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-10-16 12:42:03
cDNA的加入量应该是会影响结果的准确度的。
你看看荧光定量的原理呢。从反应过程来看。
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10楼2013-10-16 00:31:36
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学海打浪

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一般情况下溶解曲线都是在80度以上，你那个很有可能是引物二聚体
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11楼2013-10-16 11:03:17
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学海打浪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 学海打浪 at 2013-10-16 11:03:17
一般情况下溶解曲线都是在80度以上，你那个很有可能是引物二聚体

可以在做之前先用引物做一下普通pcr，然后跑下电泳看看有没有带
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12楼2013-10-16 11:04:59
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963979587

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 学海打浪 at 2013-10-16 11:04:59
可以在做之前先用引物做一下普通pcr，然后跑下电泳看看有没有带...

我也想跑电泳，琼脂糖电泳我就没跑出来过，不管是ran还是dna的，快急死了，后来想荧光定量pcr应该更准确才对，就没怎么再跑过电泳。如果是引物二聚体，也应该有目的基因的峰啊？可是我的没有啊，只有一个峰！
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15楼2013-10-16 20:54:33
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taccycle

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 963979587 at 2013-10-16 21:00:38
谢谢啊，我跑电泳使用1%的琼脂糖，还从来没有跑出来过，mark只有2000bp的，不敢再买别的了，我想知道是不是我的rna质量太差了，OD260/OD230都小于1，这样会不会影响实验结果?我的电泳都没有跑出来过条带，不管是rn ...

RNA电泳的话要用1%的胶和那个2000的Marker，如果没有电泳条带就说明你的RNA浓度有点低，那你反转录的时候可以多用点RNA，同时相应减少体系中水的用量。1%的胶不适合用来检测短片段，你至少配制个2%的胶，这样用2000的Marker也可以的
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用心
18楼2013-10-17 11:25:18
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沙门小rna

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by asr at 2013-10-14 23:29:42
20ul体系中3ug的rna反转录得到的cDNA，取4ul作为pcr的模板  

量明显太高了，先摸摸条件呀

我表示赞同斑竹。我们都是做了cdna后，稀释1倍作为模板的。也就是说假设逆转录是20μl体系，要稀释成40μl之后取1微升为模板。您这个量实在是太多了
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应助之星就是我~没错。你没有看错~
19楼2013-10-18 16:50:54
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普通回帖

963979587

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by asr at 2013-10-14 23:29:42
20ul体系中3ug的rna反转录得到的cDNA，取4ul作为pcr的模板  

量明显太高了，先摸摸条件呀

我们实验室就我自己做，都不知道从哪儿开始摸条件，我在想会不会是我提的rna质量不好造成的，OD260/OD230都在1以下，OD260/OD280还可以，不知道这样会不会影响反转录的效果？
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5楼2013-10-15 10:22:46
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963979587

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by asr at 2013-10-15 15:51:55
OD260/OD230都在1以下 这个说明什么？

你的RNA浓度是多少？ 一般反转录要求的模板量试剂盒会有要求的。...

rna浓度是500ng/ul,OD值在1以下好像是有胍盐的污染，或者是乙醇没处理干净，反转录的试剂是按要求来的，但是cDNA的浓度我没办法确定，看着说明书好像是几十ng，但是我还能按我的那个模板量跑出平台期就觉得比较奇怪，模板量这么多，做的结果没有感觉很不对，但是重现性好差。不知道是什么原因？
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7楼2013-10-15 22:01:58
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