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mahoumeimei金虫 (小有名气)
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[求助]
荧光定量PCR-绝对定量
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最近想通过定量PCR来分析不同时期体系中目标微生物的含量变化，主要是针对DNA做绝对定量。但看了一些资料后，有一点疑问。 做绝对定量事先不是需要制备质粒标准品来做标准曲线吗。资料上是说，通过克隆制备，提取出来的质粒DNA通过分光光度计测定浓度，再根据质量信息换算成目标基因含量，再稀释做标准曲线，得到目标基因含量和Ct值的关系。 可是我不明白，既然通过测定样品浓度就可以计算出目标基因的含量，为什么还要多此一举，做定量PCR呢？或者说，定量PCR的意义不仅仅是这样，但如果我的目的就是得到目的基因含量的话，其实是不需要做定量PCR的？ 新手学习中，希望大家给点建议。非常感谢！ |
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mahoumeimei: 金币+2, 自己已经想明白了，不过还是谢谢你的回复: ) 2013-03-07 16:09:55
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-04-26 21:56:20
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做绝对定量事先不是需要制备质粒标准品来做标准曲线吗。资料上是说，通过克隆制备，提取出来的质粒DNA通过分光光度计测定浓度，再根据质量信息换算成目标基因含量，再稀释做标准曲线，得到目标基因含量和Ct值的关系。 是的，需要做标准曲线。 可是我不明白，既然通过测定样品浓度就可以计算出目标基因的含量，为什么还要多此一举，做定量PCR呢？或者说，定量PCR的意义不仅仅是这样，但如果我的目的就是得到目的基因含量的话，其实是不需要做定量PCR的？ 你说的方法可以，但是只是在同一时期时可以，因为你测得总基因组的浓度。 在不同时期你要考虑时空表达问题即不同基因在不同时期表达量不一致，即整个基因组的基因并不都是同一变化规律及速率，因此，定量PCR可以解决这个问题。 |
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