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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 荧光定量PCR-绝对定量
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mahoumeimei

金虫 (小有名气)

[求助] 荧光定量PCR-绝对定量

最近想通过定量PCR来分析不同时期体系中目标微生物的含量变化，主要是针对DNA做绝对定量。但看了一些资料后，有一点疑问。
做绝对定量事先不是需要制备质粒标准品来做标准曲线吗。资料上是说，通过克隆制备，提取出来的质粒DNA通过分光光度计测定浓度，再根据质量信息换算成目标基因含量，再稀释做标准曲线，得到目标基因含量和Ct值的关系。
可是我不明白，既然通过测定样品浓度就可以计算出目标基因的含量，为什么还要多此一举，做定量PCR呢？或者说，定量PCR的意义不仅仅是这样，但如果我的目的就是得到目的基因含量的话，其实是不需要做定量PCR的？
新手学习中，希望大家给点建议。非常感谢！
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1楼2013-03-06 21:49:58
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
mahoumeimei: 金币+2, 自己已经想明白了，不过还是谢谢你的回复: ) 2013-03-07 16:09:55
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-04-26 21:56:20
做绝对定量事先不是需要制备质粒标准品来做标准曲线吗。资料上是说，通过克隆制备，提取出来的质粒DNA通过分光光度计测定浓度，再根据质量信息换算成目标基因含量，再稀释做标准曲线，得到目标基因含量和Ct值的关系。

是的，需要做标准曲线。

可是我不明白，既然通过测定样品浓度就可以计算出目标基因的含量，为什么还要多此一举，做定量PCR呢？或者说，定量PCR的意义不仅仅是这样，但如果我的目的就是得到目的基因含量的话，其实是不需要做定量PCR的？

你说的方法可以，但是只是在同一时期时可以，因为你测得总基因组的浓度。
在不同时期你要考虑时空表达问题即不同基因在不同时期表达量不一致，即整个基因组的基因并不都是同一变化规律及速率，因此，定量PCR可以解决这个问题。
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2楼2013-03-07 09:47:25
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402微笑的鱼

新虫 (初入文坛)
我也是新手，我也没搞懂楼主的问题，求解释啊！！！！
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3楼2013-03-26 11:04:39
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将上之草

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

对，可楼主所测的是总DNA 或者RNA的浓度，而你的目的DNA 或者RNA只是其中一部分，所以还是很必要去做定量的！自己的理解
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自己打败自己是最可悲的失败；自己战胜自己是最可贵的胜利。
4楼2013-04-02 15:09:04
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小孩5406

新虫 (小有名气)
“通过克隆制备，提取出来的质粒DNA通过分光光度计测定浓度，再根据质量信息换算成目标基因含量，再稀释做标准曲线，得到目标基因含量和Ct值的关系。”这里面忽略了一个问题，就是你的检测样本也要进行基因组的提取，然后才能作为模板进行pcr定量。此时出现的一个问题是，目标基因含量和Ct值在一定范围内（即要对样本和标准品进行适当的稀释作为模板）才能建立线性关系，从而确定样本中目标基因含量。另外之所以要进行PCR，是因为它同等倍数放大了目标基因的含量，从而提高了检测的灵敏度。
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5楼2016-01-08 16:15:58
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