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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 荧光定量PCR结果如何处理
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20111987

金虫 (正式写手)

[求助] 荧光定量PCR结果如何处理

大家好，我刚做完一批荧光定量PCR，结果如附件所示，但是，结果该如何处理，多种不懂啊，得到的数据各平行之间重复性不好，可能原因会有哪些？对照组和处理组结果之间的差异是否显著怎么确定？请各位大侠帮忙看一下，谢谢！
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  • 附件 1 : 实验数据.xls
    • 2012-10-05 10:22:21, 14.5 K

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1楼 2012-10-05 10:22:29
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mamadexiao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-06 17:05:56
前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100％且偏      差在  5％以内
  1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值：
           ΔCT（test)= CT （target,test) - CT （ref,test)
      ΔCT（calibrator)= CT （target, calibrator) - CT （ref, calibrator)
  2、用校准样本的ΔCT值归一试验样本的ΔCT值：
         ΔΔCT= ΔCT（test) - ΔCT（calibrator)
  3、计算表达水平比率：
                    2 –ΔΔCT=表达量的比值
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2楼2012-10-05 10:47:50
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20111987

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by mamadexiao at 2012-10-05 10:47:50
前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100％且偏      差在  5％以内
  1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值：
           ΔCT（test)= CT （target,test) - CT （ref,test)
      ΔCT（calibrator)= CT ...

我这样得到结果了，但是下一步该怎么分析，这样的结果说明什么，这几组结果之间有显著性差异吗，显著性差异又该如何分析？急求解答啊
        对照组        处理组1        处理组2        处理组3        处理组4
2 –ΔΔCT        1.00         0.59         1.36         0.88         0.96
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3楼2012-10-05 15:42:01
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20111987

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by mamadexiao at 2012-10-05 10:47:50
前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100％且偏      差在  5％以内
  1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值：
           ΔCT（test)= CT （target,test) - CT （ref,test)
      ΔCT（calibrator)= CT ...

还有就是，如果扩增效率出现20%多，会是什么原因造成的呢？
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4楼2012-10-05 15:43:19
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mamadexiao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-06 17:06:11
有没有好好念过统计学啊，每个处理一个样，你怎么做统计啊，还是说你的每个处理其实就是一个平行样》？？？
细胞实验，我们实验室要求每次3个复孔，然后平行做3-4次
动物实验，我们用的近交系的，所以一般做2-3次，最好做3次以上，每次每组4-6只老鼠
这样才能做统计
一般一个样是不做统计的，就是看个趋势
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5楼2012-10-05 20:54:14
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mamadexiao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-06 17:06:31
扩增效率20%
呃
这个。。。
你的细胞表达这个基因么
你确定么？
还有，就是你的MIX加了么。。。
有的时候，由于我们做realtime的时候，用的体系比较小，可能有的时候忘记加了。就扩增不起来了。。。
还有，我们做realtime的时候，一般每个样，都会做1-2个技术重复的。就是每次都有2-3个孔是一个样的，一模一样的东西，然后，一起看这个扩增情况的，把手抖啊什么的，都可以去掉的。。。
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6楼2012-10-05 20:58:04
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20111987

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by mamadexiao at 2012-10-05 20:54:14
有没有好好念过统计学啊，每个处理一个样，你怎么做统计啊，还是说你的每个处理其实就是一个平行样》？？？
细胞实验，我们实验室要求每次3个复孔，然后平行做3-4次
动物实验，我们用的近交系的，所以一般做2-3次 ...

我统计学的确学的不好啊，所以现在才不懂这些，我只是想知道这几个处理组与对照组相比什么情况下才算有显著性差异？
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7楼2012-10-06 08:12:20
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20111987

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by mamadexiao at 2012-10-05 20:58:04
扩增效率20%
呃
这个。。。
你的细胞表达这个基因么
你确定么？
还有，就是你的MIX加了么。。。
有的时候，由于我们做realtime的时候，用的体系比较小，可能有的时候忘记加了。就扩增不起来了。。。
还有，我 ...

我也是按您说的这么做的，第一次扩增效率挺高的，但是第二次做重复时扩增效率就出现20%多了，不知道是不是因为我用的MIX已经过期时间太长的原因。但是溶解曲线和电泳检测都证明是有扩增产物的。
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8楼2012-10-06 08:17:22
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wenzonglu

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
7楼: Originally posted by 20111987 at 2012-10-06 08:12:20
我统计学的确学的不好啊，所以现在才不懂这些，我只是想知道这几个处理组与对照组相比什么情况下才算有显著性差异？...

当然用统计软件统计看结果啦。Excell也可以简单统计
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9楼2012-10-06 09:39:21
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mamadexiao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
20111987: 金币+10, ★有帮助 2012-10-08 07:50:30
一般我们生物学上用的是P<0.05 or 0.01或者人家还有自己定的一个标准
至于具体的，麻烦你自己看看统计学的书吧，因为对象不同，分组不同，选择的统计方法也不一样。
好好学下统计学吧，别说自己不懂。。。
什么都是自己学的。
图书馆就有书，没书，网上找，总能找到的。
不是不愿意教你，而是，这个东西，你总不能每次都把数据扔这让小木虫的人给你统计分析吧。。。
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10楼2012-10-06 21:55:57
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