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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 荧光定量PCR ，条件优化
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梦飞zhu

新虫 (初入文坛)

[求助] 荧光定量PCR ，条件优化

给位大侠，我想问一下：
    1、荧光定量PCR ，条件具体怎么优化，我具体从引物浓度、退火温度进行优化。
    是不是优化一个条件就需要做一次荧光定量（比如对荧光定量PCR体系中的引物浓度进行优化，分别做50、300、600、900 nm、1、10、20、30 μm引物浓度的优化组合），还是一次荧光定量就可以把所有的优化条件都解决了，进行比较啊。
    2、标准曲线的绘制，一般用什么标准品，稀释浓度确定用分光光度计测定吗？
    新手，求助。
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1楼 2012-07-27 17:27:47
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-07-30 13:44:47
是的，qPCR不像普通PCR那样可以做梯度，调整一个条件就需要做一次。
我们常用到的qPCR supplies 及用量（1个反应，20ul体系）如下，楼主可根据这个用量适量调整：
TBSYBRmix                 10 ul
PrimerF (10uM)           0.6 ul
PrimerFR (10uM)         0.6 ul
cDNA (20ng/ul)           2 ul
Reference dye             0.4 ul
ddH2O                        6.4 ul
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6楼2012-07-30 12:31:18
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普通回帖

zcy1214

木虫 (著名写手)

普通青年
咱也是新手，共同探索哈，共同努力
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达则兼济天下，穷则独善其身
2楼2012-07-28 11:28:57
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vickie20

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
相对定量貌似不用做标准曲线哎
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3楼2012-07-29 10:50:30
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jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议先做常规PCR，在基因组水平上进行优化！
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4楼2012-07-29 19:56:50
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julin1002

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我们做相对定量PCR是不用做标准曲线的，用的是试剂盒，上面有标准的操作方法，很好用，主要是操作手法的问题
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5楼2012-07-30 08:27:28
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youlizujuan

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-01 13:33:16
你用的定量酶都有说明书，按那个来就行，引物浓度和退火温度在合适的范围内都能跑出来。稀释浓度按等倍稀释，比如5倍或10倍，不用分光光度计。
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7楼2012-07-31 20:01:10
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梦飞zhu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zcy1214 at 2012-07-28 11:28:57
咱也是新手，共同探索哈，共同努力

加油。。。
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8楼2012-08-01 15:25:22
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梦飞zhu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jl860822 at 2012-07-29 19:56:50
建议先做常规PCR，在基因组水平上进行优化！

O(∩_∩)O谢谢。。。
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9楼2012-08-01 15:25:47
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梦飞zhu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by vickie20 at 2012-07-29 10:50:30
相对定量貌似不用做标准曲线哎

O(∩_∩)O谢谢。。。
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10楼2012-08-01 15:25:56
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