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梦飞zhu

新虫 (初入文坛)

[求助] 荧光定量PCR ,条件优化

给位大侠,我想问一下:
    1、荧光定量PCR ,条件具体怎么优化,我具体从引物浓度、退火温度进行优化。
    是不是优化一个条件就需要做一次荧光定量(比如对荧光定量PCR体系中的引物浓度进行优化,分别做50、300、600、900 nm、1、10、20、30 μm引物浓度的优化组合),还是一次荧光定量就可以把所有的优化条件都解决了,进行比较啊。
    2、标准曲线的绘制,一般用什么标准品,稀释浓度确定用分光光度计测定吗?
    新手,求助。
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-07-30 13:44:47
是的,qPCR不像普通PCR那样可以做梯度,调整一个条件就需要做一次。
我们常用到的qPCR supplies 及用量(1个反应,20ul体系)如下,楼主可根据这个用量适量调整:
TBSYBRmix                 10 ul
PrimerF (10uM)           0.6 ul
PrimerFR (10uM)         0.6 ul
cDNA (20ng/ul)           2 ul
Reference dye             0.4 ul
ddH2O                        6.4 ul
6楼2012-07-30 12:31:18
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普通回帖

zcy1214

木虫 (著名写手)

普通青年

咱也是新手,共同探索哈,共同努力
达则兼济天下,穷则独善其身
2楼2012-07-28 11:28:57
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vickie20

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
相对定量貌似不用做标准曲线哎
3楼2012-07-29 10:50:30
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jl860822

金虫 (正式写手)


【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
建议先做常规PCR,在基因组水平上进行优化!
4楼2012-07-29 19:56:50
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julin1002

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我们做相对定量PCR是不用做标准曲线的,用的是试剂盒,上面有标准的操作方法,很好用,主要是操作手法的问题
5楼2012-07-30 08:27:28
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youlizujuan

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-01 13:33:16
你用的定量酶都有说明书,按那个来就行,引物浓度和退火温度在合适的范围内都能跑出来。稀释浓度按等倍稀释,比如5倍或10倍,不用分光光度计。
7楼2012-07-31 20:01:10
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梦飞zhu

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zcy1214 at 2012-07-28 11:28:57
咱也是新手,共同探索哈,共同努力

加油。。。
8楼2012-08-01 15:25:22
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梦飞zhu

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by jl860822 at 2012-07-29 19:56:50
建议先做常规PCR,在基因组水平上进行优化!

O(∩_∩)O谢谢。。。
9楼2012-08-01 15:25:47
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梦飞zhu

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by vickie20 at 2012-07-29 10:50:30
相对定量貌似不用做标准曲线哎

O(∩_∩)O谢谢。。。
10楼2012-08-01 15:25:56
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