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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 实时荧光定量pcr，cDNA的加入量会影响结果的准确度吗？
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963979587

银虫 (初入文坛)

[求助] 实时荧光定量pcr，cDNA的加入量会影响结果的准确度吗？

大家好，最近一直做荧光定量pcr，20ul体系中3ug的rna反转录得到的cDNA，取4ul作为pcr的模板，10ul EvaGreen，4ul引物，2ulRNas水，这个体系可以得到挺好的结果，但是溶解曲线的温度在77°，不知道是不是引物二聚体，而且我觉得模板的量加的太多了，实验不能重复，一次就用光了，不知道是不是应该稀释一下？
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1楼 2013-10-14 15:54:30
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沙门小rna

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by asr at 2013-10-14 23:29:42
20ul体系中3ug的rna反转录得到的cDNA，取4ul作为pcr的模板  

量明显太高了，先摸摸条件呀

我表示赞同斑竹。我们都是做了cdna后，稀释1倍作为模板的。也就是说假设逆转录是20μl体系，要稀释成40μl之后取1微升为模板。您这个量实在是太多了
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应助之星就是我~没错。你没有看错~
19楼2013-10-18 16:50:54
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沙门小rna

金虫 (正式写手)
引用回帖:
21楼: Originally posted by 963979587 at 2013-10-22 11:35:28
嗯，是挺多的，就是想知道会不会有什么负作用？...

大概会影响效率吧，你可以看看你的扩增效率。模板浓度太高不好的，有可能扩不出来。
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应助之星就是我~没错。你没有看错~
22楼2013-10-22 14:44:06
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