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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助：相对定量qRT-PCR，需要定量mRNA或者cDNA吗？
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btx362237729

金虫 (正式写手)

[求助] 求助：相对定量qRT-PCR，需要定量mRNA或者cDNA吗？

根据相对地量的原理，我们要的是目的基因和管家基因的ΔCt值，所以不管模版浓度是多少（稀释多少倍），这个ΔCt应该是不变的才对

就算标准组和待测组的模版起始浓度有差异，应该是不会影响到ΔΔCt值才对，因为ΔCt这个值不会受到模版起始浓度的影响


那么做相对定量qRT-PCR的时候，还需要去把各个组的起始RNA或者cDNA浓度搞成一致吗？

本人觉得不需要啊。。。。但是老师说一定要定量RNA，在反转录，然后cDNA稀释相同的倍数做qRT-PCR就可以了

求助：相对定量qRT-PCR，需要定量mRNA或者cDNA吗？

[ Last edited by btx362237729 on 2013-7-4 at 16:41 ]
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人生最黑暗的时光终于过去了
1楼 2013-07-04 16:40:06
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btx362237729

金虫 (正式写手)
我的天啊。。。。。。。怎么没人回答啊
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人生最黑暗的时光终于过去了
2楼2013-07-04 22:00:25
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niil

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-05 09:49:11
btx362237729: 金币+10, ★★★很有帮助, 非常感谢哦 2013-07-07 18:06:27
你说的已经很有道理了.不需要将cDNA搞成一致.但是在做反转录之前,还是需要定量RNA的,因为RNA的多少会影响反转录的效果,RNA太多,则可能不能够完全转录出来所有的cDNA,RNA太少 ,那可能造成cDNA模板浓度低.也就是尽量的让每一个样本的RNA达到一个一致的反转录效果.
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Stop fighting,let it flow.
3楼2013-07-05 08:56:24
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0700901104

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-05 09:49:17
btx362237729: 金币+10, ★★★很有帮助, 非常感谢！！！！！！ 2013-07-07 18:06:41
2楼说的很有道理，如果反转录的时候用的RNA过多反转录的效率不好，我们使用TaKaRa的荧光用的反转录试剂盒一般20ul体系仅需要1ugRNA就足够了；
对于荧光定量使用相对定量的话之前，目的基因和内参基因的标准曲线条件要摸索好，效率越接近100%越好，不行就95%-105%也可以接受。然后将你的模板稀释后一起跑目的基因和内参基因。
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别爱的太迟，别忽略了亲情，别什么都没了才后悔！
4楼2013-07-05 09:30:27
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btx362237729

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 0700901104 at 2013-07-05 09:30:27
2楼说的很有道理，如果反转录的时候用的RNA过多反转录的效率不好，我们使用TaKaRa的荧光用的反转录试剂盒一般20ul体系仅需要1ugRNA就足够了；
对于荧光定量使用相对定量的话之前，目的基因和内参基因的标准曲线条件 ...

再请问一下，扩增效率怎么看的。。。。。
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人生最黑暗的时光终于过去了
5楼2013-07-07 18:06:13
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