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btx362237729金虫 (正式写手)
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[求助]
求助：相对定量qRT-PCR，需要定量mRNA或者cDNA吗？
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根据相对地量的原理，我们要的是目的基因和管家基因的ΔCt值，所以不管模版浓度是多少（稀释多少倍），这个ΔCt应该是不变的才对 就算标准组和待测组的模版起始浓度有差异，应该是不会影响到ΔΔCt值才对，因为ΔCt这个值不会受到模版起始浓度的影响  那么做相对定量qRT-PCR的时候，还需要去把各个组的起始RNA或者cDNA浓度搞成一致吗？ 本人觉得不需要啊。。。。但是老师说一定要定量RNA，在反转录，然后cDNA稀释相同的倍数做qRT-PCR就可以了 [ Last edited by btx362237729 on 2013-7-4 at 16:41 ] |
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【答案】应助回帖
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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-05 09:49:17
btx362237729: 金币+10, ★★★很有帮助, 非常感谢！！！！！！ 2013-07-07 18:06:41
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2楼说的很有道理，如果反转录的时候用的RNA过多反转录的效率不好，我们使用TaKaRa的荧光用的反转录试剂盒一般20ul体系仅需要1ugRNA就足够了； 对于荧光定量使用相对定量的话之前，目的基因和内参基因的标准曲线条件要摸索好，效率越接近100%越好，不行就95%-105%也可以接受。然后将你的模板稀释后一起跑目的基因和内参基因。 |
4楼2013-07-05 09:30:27