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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 实时荧光定量pcr，cDNA的加入量会影响结果的准确度吗？
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银虫 (初入文坛)

[求助] 实时荧光定量pcr，cDNA的加入量会影响结果的准确度吗？

大家好，最近一直做荧光定量pcr，20ul体系中3ug的rna反转录得到的cDNA，取4ul作为pcr的模板，10ul EvaGreen，4ul引物，2ulRNas水，这个体系可以得到挺好的结果，但是溶解曲线的温度在77°，不知道是不是引物二聚体，而且我觉得模板的量加的太多了，实验不能重复，一次就用光了，不知道是不是应该稀释一下？
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1楼2013-10-14 15:54:30
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银虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-10-14 22:31:01
你的模板用量不是一般的大。通常情况下是用1μg RNA反转录后稀释5倍后取1μl做模板。把熔解曲线图发上来看看。CT值是多少？是否在15-30之间？

目的基因VCAM的CT值在25个循环左右，GAPDH在19个循环这儿，基本上都有平台期，
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4楼2013-10-15 10:20:26
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银虫 (初入文坛)
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3楼: Originally posted by asr at 2013-10-14 23:29:42
20ul体系中3ug的rna反转录得到的cDNA，取4ul作为pcr的模板  

量明显太高了，先摸摸条件呀

我们实验室就我自己做，都不知道从哪儿开始摸条件，我在想会不会是我提的rna质量不好造成的，OD260/OD230都在1以下，OD260/OD280还可以，不知道这样会不会影响反转录的效果？
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5楼2013-10-15 10:22:46
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银虫 (初入文坛)
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6楼: Originally posted by asr at 2013-10-15 15:51:55
OD260/OD230都在1以下 这个说明什么？

你的RNA浓度是多少？ 一般反转录要求的模板量试剂盒会有要求的。...

rna浓度是500ng/ul,OD值在1以下好像是有胍盐的污染，或者是乙醇没处理干净，反转录的试剂是按要求来的，但是cDNA的浓度我没办法确定，看着说明书好像是几十ng，但是我还能按我的那个模板量跑出平台期就觉得比较奇怪，模板量这么多，做的结果没有感觉很不对，但是重现性好差。不知道是什么原因？
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7楼2013-10-15 22:01:58
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银虫 (初入文坛)
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8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-10-15 22:12:45
循环数目还可以。把熔解曲线发上来看看你说的Tm问题吧，一般正常产物的熔解温度在80°C以上的。...

85°的是内参，77.9的是目的基因VCAM,这样的有问题没？
实时荧光定量pcr，cDNA的加入量会影响结果的准确度吗？
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14楼2013-10-16 20:51:12
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银虫 (初入文坛)
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12楼: Originally posted by 学海打浪 at 2013-10-16 11:04:59
可以在做之前先用引物做一下普通pcr，然后跑下电泳看看有没有带...

我也想跑电泳，琼脂糖电泳我就没跑出来过，不管是ran还是dna的，快急死了，后来想荧光定量pcr应该更准确才对，就没怎么再跑过电泳。如果是引物二聚体，也应该有目的基因的峰啊？可是我的没有啊，只有一个峰！
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15楼2013-10-16 20:54:33
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银虫 (初入文坛)
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13楼: Originally posted by taccycle at 2013-10-16 16:24:57
1、把cDNA稀释10倍的话其Ct值才增大3.2左右，只要你的Ct最后能落在33以内机器检测的准确度就没有什么影响，所以只要你目的基因的Ct值在30以内，你就可以大胆放心的稀释，你可以先稀释5倍测试一下。
2、检测有没有引 ...

谢谢啊，我跑电泳使用1%的琼脂糖，还从来没有跑出来过，mark只有2000bp的，不敢再买别的了，我想知道是不是我的rna质量太差了，OD260/OD230都小于1，这样会不会影响实验结果?我的电泳都没有跑出来过条带，不管是rna还是dna，但是pcr可以有结果，1%的胶，是不是也可以不用电泳来验证？
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16楼2013-10-16 21:00:38
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银虫 (初入文坛)
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17楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-10-17 00:09:06
感觉你的熔解峰还可以，虽然温度比较低。如果扩增曲线也是标准的S型，应该是产物了。...

谢谢啊，等有细胞了我再重新做一次，这次稀释一下做做，
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20楼2013-10-22 11:33:41
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银虫 (初入文坛)
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19楼: Originally posted by 沙门小rna at 2013-10-18 16:50:54
我表示赞同斑竹。我们都是做了cdna后，稀释1倍作为模板的。也就是说假设逆转录是20μl体系，要稀释成40μl之后取1微升为模板。您这个量实在是太多了...

嗯，是挺多的，就是想知道会不会有什么负作用？
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21楼2013-10-22 11:35:28
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银虫 (初入文坛)
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22楼: Originally posted by 沙门小rna at 2013-10-22 14:44:06
大概会影响效率吧，你可以看看你的扩增效率。模板浓度太高不好的，有可能扩不出来。...

怎么看扩增效率啊？我也觉得模板量多了不好，第二天再重复做的效果就差好多？
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23楼2013-10-22 21:37:57
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