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963979587

银虫 (初入文坛)

[求助] 实时荧光定量pcr，cDNA的加入量会影响结果的准确度吗？

大家好，最近一直做荧光定量pcr，20ul体系中3ug的rna反转录得到的cDNA，取4ul作为pcr的模板，10ul EvaGreen，4ul引物，2ulRNas水，这个体系可以得到挺好的结果，但是溶解曲线的温度在77°，不知道是不是引物二聚体，而且我觉得模板的量加的太多了，实验不能重复，一次就用光了，不知道是不是应该稀释一下？
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1楼 2013-10-14 15:54:30
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学海打浪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 学海打浪 at 2013-10-16 11:03:17
一般情况下溶解曲线都是在80度以上，你那个很有可能是引物二聚体

可以在做之前先用引物做一下普通pcr，然后跑下电泳看看有没有带
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12楼2013-10-16 11:04:59
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-15 10:27:19
你的模板用量不是一般的大。通常情况下是用1μg RNA反转录后稀释5倍后取1μl做模板。把熔解曲线图发上来看看。CT值是多少？是否在15-30之间？
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2楼2013-10-14 22:31:01
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asr

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-15 10:27:28
20ul体系中3ug的rna反转录得到的cDNA，取4ul作为pcr的模板  

量明显太高了，先摸摸条件呀
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思想极度邪恶，勿怕勿怪！\(^o^)/~
3楼2013-10-14 23:29:42
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963979587

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-10-14 22:31:01
你的模板用量不是一般的大。通常情况下是用1μg RNA反转录后稀释5倍后取1μl做模板。把熔解曲线图发上来看看。CT值是多少？是否在15-30之间？

目的基因VCAM的CT值在25个循环左右，GAPDH在19个循环这儿，基本上都有平台期，
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4楼2013-10-15 10:20:26
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