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银虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
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虫号: 1344134
注册: 2011-07-12
专业: 药理学其他科学问题

[求助] 实时荧光定量pcr，cDNA的加入量会影响结果的准确度吗？

大家好，最近一直做荧光定量pcr，20ul体系中3ug的rna反转录得到的cDNA，取4ul作为pcr的模板，10ul EvaGreen，4ul引物，2ulRNas水，这个体系可以得到挺好的结果，但是溶解曲线的温度在77°，不知道是不是引物二聚体，而且我觉得模板的量加的太多了，实验不能重复，一次就用光了，不知道是不是应该稀释一下？

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1楼 2013-10-14 15:54:30

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taccycle

铜虫 (小有名气)

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性别: GG
专业: 遗传学研究新技术与方法

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

1、把cDNA稀释10倍的话其Ct值才增大3.2左右，只要你的Ct最后能落在33以内机器检测的准确度就没有什么影响，所以只要你目的基因的Ct值在30以内，你就可以大胆放心的稀释，你可以先稀释5倍测试一下。
2、检测有没有引物二聚体你可以配一个3%的琼脂糖胶把PCR产物跑一个电泳，选择一个合适的Marker，比如DL500，引物二聚体一般都小于100bp，如果只有一条size正确的条带，那就说明没有引物二聚体
3、Tm值不能说明这个峰是不是引物二聚体，我的目的条带的Tm有的只有75℃
4、模板用量不会影响定量结果（只要不是那种极端用量），这是理论上决定的，就算有影响也是微乎其微的