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963979587

银虫 (初入文坛)

[求助] 实时荧光定量pcr，cDNA的加入量会影响结果的准确度吗？

大家好，最近一直做荧光定量pcr，20ul体系中3ug的rna反转录得到的cDNA，取4ul作为pcr的模板，10ul EvaGreen，4ul引物，2ulRNas水，这个体系可以得到挺好的结果，但是溶解曲线的温度在77°，不知道是不是引物二聚体，而且我觉得模板的量加的太多了，实验不能重复，一次就用光了，不知道是不是应该稀释一下？
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1楼 2013-10-14 15:54:30
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taccycle

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1、把cDNA稀释10倍的话其Ct值才增大3.2左右，只要你的Ct最后能落在33以内机器检测的准确度就没有什么影响，所以只要你目的基因的Ct值在30以内，你就可以大胆放心的稀释，你可以先稀释5倍测试一下。
2、检测有没有引物二聚体你可以配一个3%的琼脂糖胶把PCR产物跑一个电泳，选择一个合适的Marker，比如DL500，引物二聚体一般都小于100bp，如果只有一条size正确的条带，那就说明没有引物二聚体
3、Tm值不能说明这个峰是不是引物二聚体，我的目的条带的Tm有的只有75℃
4、模板用量不会影响定量结果（只要不是那种极端用量），这是理论上决定的，就算有影响也是微乎其微的
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用心
13楼2013-10-16 16:24:57
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-15 10:27:19
你的模板用量不是一般的大。通常情况下是用1μg RNA反转录后稀释5倍后取1μl做模板。把熔解曲线图发上来看看。CT值是多少？是否在15-30之间？
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2楼2013-10-14 22:31:01
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asr

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-15 10:27:28
20ul体系中3ug的rna反转录得到的cDNA，取4ul作为pcr的模板  

量明显太高了，先摸摸条件呀
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思想极度邪恶，勿怕勿怪！\(^o^)/~
3楼2013-10-14 23:29:42
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963979587

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-10-14 22:31:01
你的模板用量不是一般的大。通常情况下是用1μg RNA反转录后稀释5倍后取1μl做模板。把熔解曲线图发上来看看。CT值是多少？是否在15-30之间？

目的基因VCAM的CT值在25个循环左右，GAPDH在19个循环这儿，基本上都有平台期，
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4楼2013-10-15 10:20:26
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