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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 综合其他 » 【求助/交流】普通PCR和荧光实时定量PCR为何结果不同？
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晓夜

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】普通PCR和荧光实时定量PCR为何结果不同？

我要检测一个基因在牛卵不同时期的表达情况，可以分为1，2，3，4，5共5个时期，但是普通PCR后电泳，结果是1，2没有条带，3，4，5都有较明显的条带。荧光实时定量PCR后，分析出的柱状图显示第5个时期表达量最小，其他1，2，3，4都比5的表达量高，这是为什么呢？？？另外，我把荧光实时定量PCR后的产物电泳，结果是1，2，3，4，5时期都有170bp的条带（荧光实时定量的产物为170bp），跟柱状图结果应该一直。 但是普通PCR明明是1，2没有目的条带啊！
注：我检测的基因片段为540，普通PCR扩增的是整个基因540bp，而荧光定量扩的该基因其中一段170bp，荧光定量引物没有问题（已验证）
求高人指点一二啊，本人不胜感激。谢谢！！！
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1楼2010-12-19 09:24:05
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
dhd997(金币+2):good 2010-12-19 09:32:10
晓夜(金币+1): 谢谢啦 2011-04-26 00:02:22
首先做定量有没有用内参校正？
其次，普通PCR你的模板是什么？gDNA还是cDNA？
第三，普通PCR的循环数是多少？
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2楼2010-12-19 09:29:19
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晓夜

金虫 (小有名气)
内参校正不太明白，我用的是CDNA，实时定量和普通PCR都是40个循环。
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3楼2010-12-20 23:04:46
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晓夜

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 晓夜 at 2010-12-19 09:24:05:
我要检测一个基因在牛卵不同时期的表达情况，可以分为1，2，3，4，5共5个时期，但是普通PCR后电泳，结果是1，2没有条带，3，4，5都有较明显的条带。荧光实时定量PCR后，分析出的柱状图显示第5个时期表达量最小，其 ...

内参校正不太明白，我用的是CDNA，实时定量和普通PCR都是40个循环。
本文来自: 小木虫论坛 http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2714927&pid=1164641&page=1#pid1164641
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4楼2010-12-20 23:05:16
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
晓夜(金币+1): 谢谢 2011-04-26 00:02:47
看来你还没明白实时定量和半定量的原理啊~~
怎么从头开始讲好=v=

要不这样，你去查以下几个问题

1、内参的作用
2、为何终点法定量不准
3、半定量PCR为何要严格控制循环数
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5楼2010-12-20 23:34:39
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