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963979587

银虫 (初入文坛)

[求助] 实时荧光定量pcr,cDNA的加入量会影响结果的准确度吗?

大家好,最近一直做荧光定量pcr,20ul体系中3ug的rna反转录得到的cDNA,取4ul作为pcr的模板,10ul EvaGreen,4ul引物,2ulRNas水,这个体系可以得到挺好的结果,但是溶解曲线的温度在77°,不知道是不是引物二聚体,而且我觉得模板的量加的太多了,实验不能重复,一次就用光了,不知道是不是应该稀释一下?
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963979587

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-10-15 22:12:45
循环数目还可以。把熔解曲线发上来看看你说的Tm问题吧,一般正常产物的熔解温度在80°C以上的。...

85°的是内参,77.9的是目的基因VCAM,这样的有问题没?
实时荧光定量pcr,cDNA的加入量会影响结果的准确度吗?
101111.png

14楼2013-10-16 20:51:12
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-10-15 10:27:19
你的模板用量不是一般的大。通常情况下是用1μg RNA反转录后稀释5倍后取1μl做模板。把熔解曲线图发上来看看。CT值是多少?是否在15-30之间?
2楼2013-10-14 22:31:01
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asr

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-10-15 10:27:28
20ul体系中3ug的rna反转录得到的cDNA,取4ul作为pcr的模板  

量明显太高了,先摸摸条件呀
思想极度邪恶,勿怕勿怪!\(^o^)/~
3楼2013-10-14 23:29:42
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963979587

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-10-14 22:31:01
你的模板用量不是一般的大。通常情况下是用1μg RNA反转录后稀释5倍后取1μl做模板。把熔解曲线图发上来看看。CT值是多少?是否在15-30之间?

目的基因VCAM的CT值在25个循环左右,GAPDH在19个循环这儿,基本上都有平台期,
4楼2013-10-15 10:20:26
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