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11楼2013-10-16 11:03:17

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学海打浪

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11楼: Originally posted by 学海打浪 at 2013-10-16 11:03:17
一般情况下溶解曲线都是在80度以上，你那个很有可能是引物二聚体

可以在做之前先用引物做一下普通pcr，然后跑下电泳看看有没有带

12楼2013-10-16 11:04:59

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taccycle

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1、把cDNA稀释10倍的话其Ct值才增大3.2左右，只要你的Ct最后能落在33以内机器检测的准确度就没有什么影响，所以只要你目的基因的Ct值在30以内，你就可以大胆放心的稀释，你可以先稀释5倍测试一下。
2、检测有没有引物二聚体你可以配一个3%的琼脂糖胶把PCR产物跑一个电泳，选择一个合适的Marker，比如DL500，引物二聚体一般都小于100bp，如果只有一条size正确的条带，那就说明没有引物二聚体
3、Tm值不能说明这个峰是不是引物二聚体，我的目的条带的Tm有的只有75℃
4、模板用量不会影响定量结果（只要不是那种极端用量），这是理论上决定的，就算有影响也是微乎其微的

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用心

13楼2013-10-16 16:24:57

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8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-10-15 22:12:45
循环数目还可以。把熔解曲线发上来看看你说的Tm问题吧，一般正常产物的熔解温度在80°C以上的。...

85°的是内参，77.9的是目的基因VCAM,这样的有问题没？

101111.png

14楼2013-10-16 20:51:12

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12楼: Originally posted by 学海打浪 at 2013-10-16 11:04:59
可以在做之前先用引物做一下普通pcr，然后跑下电泳看看有没有带...

我也想跑电泳，琼脂糖电泳我就没跑出来过，不管是ran还是dna的，快急死了，后来想荧光定量pcr应该更准确才对，就没怎么再跑过电泳。如果是引物二聚体，也应该有目的基因的峰啊？可是我的没有啊，只有一个峰！

15楼2013-10-16 20:54:33

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13楼: Originally posted by taccycle at 2013-10-16 16:24:57
1、把cDNA稀释10倍的话其Ct值才增大3.2左右，只要你的Ct最后能落在33以内机器检测的准确度就没有什么影响，所以只要你目的基因的Ct值在30以内，你就可以大胆放心的稀释，你可以先稀释5倍测试一下。
2、检测有没有引 ...

谢谢啊，我跑电泳使用1%的琼脂糖，还从来没有跑出来过，mark只有2000bp的，不敢再买别的了，我想知道是不是我的rna质量太差了，OD260/OD230都小于1，这样会不会影响实验结果?我的电泳都没有跑出来过条带，不管是rna还是dna，但是pcr可以有结果，1%的胶，是不是也可以不用电泳来验证？

16楼2013-10-16 21:00:38

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cicelyzh

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14楼: Originally posted by 963979587 at 2013-10-16 20:51:12
85°的是内参，77.9的是目的基因VCAM,这样的有问题没？

101111.png
...

感觉你的熔解峰还可以，虽然温度比较低。如果扩增曲线也是标准的S型，应该是产物了。

17楼2013-10-17 00:09:06

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taccycle

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16楼: Originally posted by 963979587 at 2013-10-16 21:00:38
谢谢啊，我跑电泳使用1%的琼脂糖，还从来没有跑出来过，mark只有2000bp的，不敢再买别的了，我想知道是不是我的rna质量太差了，OD260/OD230都小于1，这样会不会影响实验结果?我的电泳都没有跑出来过条带，不管是rn ...

RNA电泳的话要用1%的胶和那个2000的Marker，如果没有电泳条带就说明你的RNA浓度有点低，那你反转录的时候可以多用点RNA，同时相应减少体系中水的用量。1%的胶不适合用来检测短片段，你至少配制个2%的胶，这样用2000的Marker也可以的

用心

18楼2013-10-17 11:25:18

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3楼: Originally posted by asr at 2013-10-14 23:29:42
20ul体系中3ug的rna反转录得到的cDNA，取4ul作为pcr的模板

量明显太高了，先摸摸条件呀

我表示赞同斑竹。我们都是做了cdna后，稀释1倍作为模板的。也就是说假设逆转录是20μl体系，要稀释成40μl之后取1微升为模板。您这个量实在是太多了

应助之星就是我~没错。你没有看错~

19楼2013-10-18 16:50:54

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17楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-10-17 00:09:06
感觉你的熔解峰还可以，虽然温度比较低。如果扩增曲线也是标准的S型，应该是产物了。...

谢谢啊，等有细胞了我再重新做一次，这次稀释一下做做，