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963979587

银虫 (初入文坛)

[求助] 实时荧光定量pcr,cDNA的加入量会影响结果的准确度吗?

大家好,最近一直做荧光定量pcr,20ul体系中3ug的rna反转录得到的cDNA,取4ul作为pcr的模板,10ul EvaGreen,4ul引物,2ulRNas水,这个体系可以得到挺好的结果,但是溶解曲线的温度在77°,不知道是不是引物二聚体,而且我觉得模板的量加的太多了,实验不能重复,一次就用光了,不知道是不是应该稀释一下?
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taccycle

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
16楼: Originally posted by 963979587 at 2013-10-16 21:00:38
谢谢啊,我跑电泳使用1%的琼脂糖,还从来没有跑出来过,mark只有2000bp的,不敢再买别的了,我想知道是不是我的rna质量太差了,OD260/OD230都小于1,这样会不会影响实验结果?我的电泳都没有跑出来过条带,不管是rn ...

RNA电泳的话要用1%的胶和那个2000的Marker,如果没有电泳条带就说明你的RNA浓度有点低,那你反转录的时候可以多用点RNA,同时相应减少体系中水的用量。1%的胶不适合用来检测短片段,你至少配制个2%的胶,这样用2000的Marker也可以的
用心
18楼2013-10-17 11:25:18
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-10-15 10:27:19
你的模板用量不是一般的大。通常情况下是用1μg RNA反转录后稀释5倍后取1μl做模板。把熔解曲线图发上来看看。CT值是多少?是否在15-30之间?
2楼2013-10-14 22:31:01
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asr

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-10-15 10:27:28
20ul体系中3ug的rna反转录得到的cDNA,取4ul作为pcr的模板  

量明显太高了,先摸摸条件呀
思想极度邪恶,勿怕勿怪!\(^o^)/~
3楼2013-10-14 23:29:42
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963979587

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-10-14 22:31:01
你的模板用量不是一般的大。通常情况下是用1μg RNA反转录后稀释5倍后取1μl做模板。把熔解曲线图发上来看看。CT值是多少?是否在15-30之间?

目的基因VCAM的CT值在25个循环左右,GAPDH在19个循环这儿,基本上都有平台期,
4楼2013-10-15 10:20:26
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