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963979587

银虫 (初入文坛)

[求助] 实时荧光定量pcr，cDNA的加入量会影响结果的准确度吗？

大家好，最近一直做荧光定量pcr，20ul体系中3ug的rna反转录得到的cDNA，取4ul作为pcr的模板，10ul EvaGreen，4ul引物，2ulRNas水，这个体系可以得到挺好的结果，但是溶解曲线的温度在77°，不知道是不是引物二聚体，而且我觉得模板的量加的太多了，实验不能重复，一次就用光了，不知道是不是应该稀释一下？
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1楼 2013-10-14 15:54:30
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taccycle

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 963979587 at 2013-10-16 21:00:38
谢谢啊，我跑电泳使用1%的琼脂糖，还从来没有跑出来过，mark只有2000bp的，不敢再买别的了，我想知道是不是我的rna质量太差了，OD260/OD230都小于1，这样会不会影响实验结果?我的电泳都没有跑出来过条带，不管是rn ...

RNA电泳的话要用1%的胶和那个2000的Marker，如果没有电泳条带就说明你的RNA浓度有点低，那你反转录的时候可以多用点RNA，同时相应减少体系中水的用量。1%的胶不适合用来检测短片段，你至少配制个2%的胶，这样用2000的Marker也可以的
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用心
18楼2013-10-17 11:25:18
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-15 10:27:19
你的模板用量不是一般的大。通常情况下是用1μg RNA反转录后稀释5倍后取1μl做模板。把熔解曲线图发上来看看。CT值是多少？是否在15-30之间？
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2楼2013-10-14 22:31:01
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asr

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-15 10:27:28
20ul体系中3ug的rna反转录得到的cDNA，取4ul作为pcr的模板  

量明显太高了，先摸摸条件呀
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思想极度邪恶，勿怕勿怪！\(^o^)/~
3楼2013-10-14 23:29:42
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963979587

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-10-14 22:31:01
你的模板用量不是一般的大。通常情况下是用1μg RNA反转录后稀释5倍后取1μl做模板。把熔解曲线图发上来看看。CT值是多少？是否在15-30之间？

目的基因VCAM的CT值在25个循环左右，GAPDH在19个循环这儿，基本上都有平台期，
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4楼2013-10-15 10:20:26
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