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cnb1987

银虫 (小有名气)

[求助] 做荧光定量时看家基因的CT值?

大家好,最近在做荧光定量,做了几次之后,发现看家基因的CT值都在30左右,是不是我的模版量加的太少还是cDNA有问题?,一般三个重复三个,有的品均值值还在33左右,大家能给我点意见么?
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
cnb1987: 金币+2, 有帮助 2013-03-08 12:26:05
PCR时加大cDNA用量或者逆转录时增加RNA用量。
2楼2013-03-08 11:14:16
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lhs521521

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
cnb1987: 金币+2, 有帮助 2013-03-08 12:26:31
那个CT值是和cDNA量相反关系,CT值越大说明模板浓度低,加大模板量,而且CT值在25-33,个人认为都可以!
寻找真正的自我!
3楼2013-03-08 11:36:46
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lidonghong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
cnb1987: 金币+2, 有帮助 2013-03-08 12:26:44
管家基因的ct值都在30左右的话说明你的cNDA含量较低,PCR本身没有问题,解决方法上面的两位说的都很有理
生物化学与分子生物学
4楼2013-03-08 11:58:46
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cnb1987

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-08 11:14:16
PCR时加大cDNA用量或者逆转录时增加RNA用量。

嗯,好的,我再加点模版尝试一下!
5楼2013-03-08 12:25:59
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hy_sandra

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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cnb1987: 金币+4, ★★★★★最佳答案 2013-03-08 17:00:32
小丹木木: 金币+5, 鼓励应助,欢迎新虫虫 2013-03-08 17:33:12
加模版通常變動不大,因螢光R值是取10的對數?K對應至ct,所以就算增量2倍,螢光增加兩倍,也只會增加約0.3個ct。所以要看,你的看家基因產物大小,一般不要超過300bp為佳,再?硪茨阍O的programe, 也許要改一下比較適合。可以把你的條件寫一下,大家可幫忙

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
科研是無止盡的
6楼2013-03-08 15:22:40
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cnb1987

银虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by hy_sandra at 2013-03-08 15:22:40
加模版通常變動不大,因螢光R值是取10的對數?K對應至ct,所以就算增量2倍,螢光增加兩倍,也只會增加約0.3個ct。所以要看,你的看家基因產物大小,一般不要超過300bp為佳,再?硪茨阍O的programe, 也許要改一下比較 ...

好的!
我20ul 体系 模版加0.8ul
Stage 1 95℃  5min
Stage 2(Reps 40) 95℃  15s, 58℃  15s, 72℃  30s
Stage3 95℃ 15s, 60℃ 30s, 95℃ 15s
产物都很小都是一百左右!
7楼2013-03-08 17:00:26
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hy_sandra

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

一般?碚f,用2ugRNA轉成cDNA(體積為20ul),拿1ul作real time PCR,其actin約為18~22ct,而GAPDH則多一點會到25ct左右。看了一下,programe應沒太大問題, 只是annealing溫度若是高於50度,我的時間不會設這麼短,至少也20秒。也許你可以先用一般pcr後再跑gel看看,可以確定programe及產物沒問題。還有,我的經驗是,若當初提取RNA後,回溶的體積太大,以致於定量的的OD小於0.3,以至於之後的ct會變多很多

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
科研是無止盡的
8楼2013-03-09 15:53:12
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杨童旺

新虫 (小有名气)

亲,你最后怎么解决的啊,教教我把
向着自己的目标冲吧!
9楼2014-12-11 12:51:34
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