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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 做荧光定量时看家基因的CT值？
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cnb1987

银虫 (小有名气)

[求助] 做荧光定量时看家基因的CT值？

大家好，最近在做荧光定量，做了几次之后，发现看家基因的CT值都在30左右，是不是我的模版量加的太少还是cDNA有问题？，一般三个重复三个，有的品均值值还在33左右，大家能给我点意见么？
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1楼 2013-03-08 11:12:10
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
cnb1987: 金币+2, ★有帮助 2013-03-08 12:26:05
PCR时加大cDNA用量或者逆转录时增加RNA用量。
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2楼2013-03-08 11:14:16
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lhs521521

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
cnb1987: 金币+2, ★有帮助 2013-03-08 12:26:31
那个CT值是和cDNA量相反关系，CT值越大说明模板浓度低，加大模板量，而且CT值在25-33，个人认为都可以！
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寻找真正的自我！
3楼2013-03-08 11:36:46
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lidonghong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
cnb1987: 金币+2, ★有帮助 2013-03-08 12:26:44
管家基因的ct值都在30左右的话说明你的cNDA含量较低，PCR本身没有问题，解决方法上面的两位说的都很有理
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生物化学与分子生物学
4楼2013-03-08 11:58:46
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cnb1987

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-08 11:14:16
PCR时加大cDNA用量或者逆转录时增加RNA用量。

嗯，好的，我再加点模版尝试一下！
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5楼2013-03-08 12:25:59
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hy_sandra

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
cnb1987: 金币+4, ★★★★★最佳答案 2013-03-08 17:00:32
小丹木木: 金币+5, 鼓励应助，欢迎新虫虫 2013-03-08 17:33:12
加模版通常變動不大，因螢光R值是取10的對數?K對應至ct，所以就算增量2倍，螢光增加兩倍，也只會增加約0.3個ct。所以要看，你的看家基因產物大小，一般不要超過300bp為佳，再?硪茨阍O的programe, 也許要改一下比較適合。可以把你的條件寫一下，大家可幫忙

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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科研是無止盡的
6楼2013-03-08 15:22:40
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cnb1987

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by hy_sandra at 2013-03-08 15:22:40
加模版通常變動不大，因螢光R值是取10的對數?K對應至ct，所以就算增量2倍，螢光增加兩倍，也只會增加約0.3個ct。所以要看，你的看家基因產物大小，一般不要超過300bp為佳，再?硪茨阍O的programe, 也許要改一下比較 ...

好的！
我20ul 体系 模版加0.8ul
Stage 1 95℃  5min
Stage 2(Reps 40) 95℃  15s, 58℃  15s, 72℃  30s
Stage3 95℃ 15s, 60℃ 30s, 95℃ 15s
产物都很小都是一百左右！
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7楼2013-03-08 17:00:26
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hy_sandra

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

一般?碚f，用2ugRNA轉成cDNA(體積為20ul)，拿1ul作real time PCR，其actin約為18~22ct,而GAPDH則多一點會到25ct左右。看了一下，programe應沒太大問題, 只是annealing溫度若是高於50度，我的時間不會設這麼短，至少也20秒。也許你可以先用一般pcr後再跑gel看看，可以確定programe及產物沒問題。還有，我的經驗是，若當初提取RNA後,回溶的體積太大，以致於定量的的OD小於0.3，以至於之後的ct會變多很多

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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科研是無止盡的
8楼2013-03-09 15:53:12
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杨童旺

新虫 (小有名气)
亲，你最后怎么解决的啊，教教我把
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向着自己的目标冲吧！
9楼2014-12-11 12:51:34
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