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zhangyep121

铜虫 (小有名气)

[求助] 跟大家请教一个荧光定量PCR的问题 已有2人参与

注意是荧光定量PCR，不是普通PCR，现在由于一些特殊原因，我想设计一组引物，扩增片段长度为1200bp左右，请问有没有可行性，将变性和延伸时间加长可以吗？探针设计有特殊要求吗？主要问题是这么长的扩增片段主要会出现什么问题，请各位帮忙，谢谢啦！
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1楼 2013-10-09 16:56:40
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+2, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待更详细的解答 2013-10-09 22:00:09
zhangyep121: 金币+5, ★有帮助, 谢谢，离5段近一些这个建议不错，会考虑一下 2013-10-10 08:50:37
一般荧光定量PCR扩增片段在100-200bp, 如果要1200bp,应该不是为了检测这个基因存在不存在，或者像检测PCR反应的进程吧？

理论上应该是可行的，扩增的时间延长，而且1200长的产物，在设计探针的时候，选择的余地很大。在延伸的过程中，遇到探针后开始切除检测释放出荧光，所以探针的5’端离引物近一些的话，荧光就会出现的快一些。

没有做过，但是很有兴趣知道实验结果。

楼主好运！
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行至水穷处，坐看云起时
2楼2013-10-09 17:10:23
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r529887327

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+2, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待更详细的解答 2013-10-09 22:00:16
zhangyep121: 金币+5, ★有帮助, 谢谢啦！ 2013-10-10 08:55:34
个人觉得扩增片段太长了，影响荧光信号的分辨率进而定量效果。
为什么非要这么长的扩增产物呢？
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3楼2013-10-09 17:47:17
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zgb1982

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待更详细的解答 2013-10-09 22:00:23
不知道你实验的目的是什么，这么长的片段可能扩增效率是个问题，很难检测到准确的表达量吧。好像设计短的产物片段就是因为扩增效率问题吧。
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4楼2013-10-09 20:54:43
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zhangyep121

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by r529887327 at 2013-10-09 17:47:17
个人觉得扩增片段太长了，影响荧光信号的分辨率进而定量效果。
为什么非要这么长的扩增产物呢？

您好，其实这么长的扩增片段也是迫不得已的，想跟您讨论一下，扩增片段过长是如何影响荧光信号分辨率呢？是因为延伸速率变长的原因吗？如楼上所说，设计探针靠近上游引物或者下游引物可以吗？
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5楼2013-10-10 09:00:41
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FHheh

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你好，请问你有做出这么长片段的定量PCR吗？我在做400多bp的定量PCR，普通的可以P出来，定量的却P不出来！请问大片段的产物定量PCR是不是要将退火与延伸分开啊？或是有其他什么需要注意的？谢谢！
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6楼2013-12-22 10:06:42
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zhangyep121

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by FHheh at 2013-12-22 10:06:42
你好，请问你有做出这么长片段的定量PCR吗？我在做400多bp的定量PCR，普通的可以P出来，定量的却P不出来！请问大片段的产物定量PCR是不是要将退火与延伸分开啊？或是有其他什么需要注意的？谢谢！

你好，我这边可以做出定量来，给你的建议是最好使用fast taq酶（普通的也可以），延伸和退火温度是要分开，而且时间要比较长（我的延伸时间是90s），探针设计位置接近上引物，祝你成功！
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7楼2013-12-24 15:09:48
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
zhangyep121: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢，酶活下降是个问题，我这边已经做出来了，效果还可以 2013-12-27 11:08:49
长时间加热酶活力下降，随dNTP浓度下降扩增效率将下降，扩增效率不稳定不能准确定量。
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8楼2013-12-25 18:05:00
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