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没入尘埃5

金虫 (小有名气)

[求助] 荧光定量PCR与普通PCR

我们实验室做检测时都是先用普通PCR检测，看着条带好再用实时定量检测，有一个基因在琼脂糖凝胶上看着条带是单一的，为什么在做荧光定量的时候溶解曲线是这样的呢？请大家多多帮助，十分感谢~~~
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如果不努力，肯定没收获！
1楼 2013-04-02 15:21:44
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
没入尘埃5(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-04-29 14:30:05
引用回帖:
9楼: Originally posted by 没入尘埃5 at 2013-04-04 11:49:43
所以我琼脂糖胶上那个60bp左右的条带是引物二聚体，我也是这样认为的，这样可用的吧？...

做定量的话引物要求不能形成二聚体，因为引物二聚体也会发荧光，影响定量。而且引物二聚体的形成也会影响PCR的扩增效率。
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没入尘埃5
10楼2013-04-04 13:41:18
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普通回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励应助！ 2013-04-02 19:19:26
普通PCR检测灵敏度比荧光定量差很多。能看到条带时早就过了荧光定量的检测限。所以，即使普通PCR上是一条带，不一定说明荧光定量时候效果就很好。此外，荧光定量的酶和体系与普通PCR的不一样，普通PCR优化的最佳退火温度与荧光定量时未必一样。感觉你需要优化荧光定量PCR的反应程序。如果实在不行的话，说明可能需要更换引物。
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没入尘埃5
2楼2013-04-02 15:38:08
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没入尘埃5

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-02 15:38:08
普通PCR检测灵敏度比荧光定量差很多。能看到条带时早就过了荧光定量的检测限。所以，即使普通PCR上是一条带，不一定说明荧光定量时候效果就很好。此外，荧光定量的酶和体系与普通PCR的不一样，普通PCR优化的最佳退火 ...

嗯，就是说如果荧光定量的溶解曲线不好，就是效果不好，普通PCR那个其实不能说明什么问题啊
还有一个问题就是，我的看家基因普通PCR后，在4%的琼脂糖凝胶上显示两条带，我的目的基因是80bp左右的，还有一条在60bp左右，但是在荧光定量上的溶解曲线显示挺好的，这样是不是就没有问题?
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如果不努力，肯定没收获！
3楼2013-04-02 18:16:32
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
没入尘埃5: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-04-03 09:02:03
gyesang: 金币+2, 鼓励应助！ 2013-04-05 13:26:40
引用回帖:
3楼: Originally posted by 没入尘埃5 at 2013-04-02 18:16:32
嗯，就是说如果荧光定量的溶解曲线不好，就是效果不好，普通PCR那个其实不能说明什么问题啊
还有一个问题就是，我的看家基因普通PCR后，在4%的琼脂糖凝胶上显示两条带，我的目的基因是80bp左右的，还有一条在60bp ...

做荧光定量一般不看普通PCR的效果，的确是因为普通PCR结果好也根本不说明什么问题。但是，如果普通PCR显示有两条带，说明产物不单一，应该算是有问题吧。不知道你说的应该定量的熔接曲线好是什么意思。我觉得一般情况下普通PCR能P出两条带的话，荧光定量的熔接曲线应该很难是单一的锐峰。
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没入尘埃5
4楼2013-04-02 22:32:39
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没入尘埃5

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-02 22:32:39
做荧光定量一般不看普通PCR的效果，的确是因为普通PCR结果好也根本不说明什么问题。但是，如果普通PCR显示有两条带，说明产物不单一，应该算是有问题吧。不知道你说的应该定量的熔接曲线好是什么意思。我觉得一般情 ...

因为我的条带是80bp左右的，另一条在60bp左右，60的是不是就是引物二聚体了？溶解曲线是一个很高的单峰，我不知道怎么往这上面贴图，传了也看不见
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5楼2013-04-03 09:01:48
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
没入尘埃5(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-04-29 14:29:40
引用回帖:
5楼: Originally posted by 没入尘埃5 at 2013-04-03 09:01:48
因为我的条带是80bp左右的，另一条在60bp左右，60的是不是就是引物二聚体了？溶解曲线是一个很高的单峰，我不知道怎么往这上面贴图，传了也看不见...

如果出现引物二聚体，熔解曲线会有反映。熔解峰的温度是多少？峰是否单一？主峰前面是否有小峰？看了你传的两张图，感觉很怪啊。正常产物的熔解峰的温度在80°C以上。
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6楼2013-04-03 09:40:54
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没入尘埃5

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-03 09:40:54
如果出现引物二聚体，熔解曲线会有反映。熔解峰的温度是多少？峰是否单一？主峰前面是否有小峰？看了你传的两张图，感觉很怪啊。正常产物的熔解峰的温度在80°C以上。...

我的看家基因的溶解峰的温度是84℃，那两张是我说的琼脂糖胶是一条带，但是溶解曲线不好的那两个，这个是我的看家基因，溶解曲线算是单一的峰吧？

@5G}{D{AZ~`R90L9)~V20@S.jpg
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7楼2013-04-03 18:38:34
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
没入尘埃5(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-04-29 14:29:53
引用回帖:
7楼: Originally posted by 没入尘埃5 at 2013-04-03 18:38:34
我的看家基因的溶解峰的温度是84℃，那两张是我说的琼脂糖胶是一条带，但是溶解曲线不好的那两个，这个是我的看家基因，溶解曲线算是单一的峰吧？

@5G}{D{AZ~`R90L9)~V20@S.jpg
...

除了84°C的主峰外，78°C有个小峰，觉得小峰是引物二聚体。
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没入尘埃5
8楼2013-04-04 02:37:18
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没入尘埃5

金虫 (小有名气)
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8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-04 02:37:18
除了84°C的主峰外，78°C有个小峰，觉得小峰是引物二聚体。...

所以我琼脂糖胶上那个60bp左右的条带是引物二聚体，我也是这样认为的，这样可用的吧？
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9楼2013-04-04 11:49:43
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