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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请教PCR高手，使用SYBR Green I法进行荧光定量PCR对于产物大小有什么要求？
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czcpudai

铜虫 (正式写手)

[求助] 请教PCR高手，使用SYBR Green I法进行荧光定量PCR对于产物大小有什么要求？ 已有3人参与

本人打算做荧光定量PCR，现在做了普通的rt-pcr，三种基因的大小为352bp，362bp，228bp，结果都扩增出来了，下一步打算做荧光定量RT-PCR，荧光染料为SYBR，请问是不是可以接着使用普通Rt-PCR中所使用的引物呢，还是重新设计引物，使其产物大小在50-150bp之间？？？求解答？？
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1楼 2012-08-21 15:12:27
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mutou1025

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-22 15:16:25
一般在100bp左右，重新设计引物。你的300多bp太大了。SYBR我记得程序变形退火时间 好像比普通PCR时间短。太大了会不会没有完全P出来啊
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2楼2012-08-22 13:25:33
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ywding0628

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-22 15:16:34
一般都在80-150bp之间，建议重新设计引物。如果是SOSO FAST（BIORAD）的mix， 退火延伸一共只有5s。
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性格埋下了人生的伏笔~
3楼2012-08-22 14:31:18
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助，七夕快乐 2012-08-23 15:55:31
228可以试试。
我做过80-400bp的，200多点有的引物还是可以的，但是片段太长PCR效率就有点低，并且有非特异PEAK, 我一般用60度退火，但是提高温度到65度，可以减少或者消除非特异PEAK.
具体条件不能完全根据报道，具体情况具体分析，不过个人觉得，100-200左右的就很好。如果你的228效果不好，可以试试重新设计引物把目标片段定于150bp左右。
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4楼2012-08-22 20:18:01
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助，七夕快乐 2012-08-23 15:55:52
我用的条件是，
     95度 1分钟，
45 X  95度 15秒
     65度 （具体温度需要自己调整，我用的是65,他人可能一般用60度） 45秒
最后是MELT CUVE,
        95度   15秒
     65度   45秒
     95度   15秒
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5楼2012-08-22 20:20:35
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by mutou1025 at 2012-08-22 13:25:33
一般在100bp左右，重新设计引物。你的300多bp太大了。SYBR我记得程序变形退火时间 好像比普通PCR时间短。太大了会不会没有完全P出来啊

哦 谢谢哈！
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6楼2012-08-23 14:29:20
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by chenguestc at 2012-08-22 20:18:01
228可以试试。
我做过80-400bp的，200多点有的引物还是可以的，但是片段太长PCR效率就有点低，并且有非特异PEAK, 我一般用60度退火，但是提高温度到65度，可以减少或者消除非特异PEAK.
具体条件不能完全根据报道， ...

恩，非常感谢！我觉得您说的挺对的，只是引物要跨外显子设计，自己设计了一下但是没有找到合适的，要么特异性低，要么Tm值相差超过2度，还是仔细再找找吧
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7楼2012-08-23 14:36:59
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by chenguestc at 2012-08-22 20:20:35
我用的条件是，
     95度 1分钟，
45 X  95度 15秒
     65度 （具体温度需要自己调整，我用的是65,他人可能一般用60度） 45秒
最后是MELT CUVE,
        95度   15秒
     65度   45秒
     95度   15秒

借鉴了！
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8楼2012-08-23 14:37:27
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阿菁

新虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
9楼2012-11-01 12:01:43
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dayulee

木虫 (正式写手)

愚木虫

【答案】应助回帖

你们设计荧光的引物是用什么软件设计啊
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好好学习，天天向上
10楼2012-12-03 11:34:30
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