24小时热门版块排行榜    

北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
查看: 4403  |  回复: 21

czcpudai

铜虫 (正式写手)

[求助] 请教PCR高手,使用SYBR Green I法进行荧光定量PCR对于产物大小有什么要求? 已有3人参与

本人打算做荧光定量PCR,现在做了普通的rt-pcr,三种基因的大小为352bp,362bp,228bp,结果都扩增出来了,下一步打算做荧光定量RT-PCR,荧光染料为SYBR,请问是不是可以接着使用普通Rt-PCR中所使用的引物呢,还是重新设计引物,使其产物大小在50-150bp之间???求解答??
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

mutou1025

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-22 15:16:25
一般在100bp左右,重新设计引物。你的300多bp太大了。SYBR我记得程序变形退火时间 好像比普通PCR时间短。太大了会不会没有完全P出来啊
2楼2012-08-22 13:25:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ywding0628

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-22 15:16:34
一般都在80-150bp之间,建议重新设计引物。如果是SOSO FAST(BIORAD)的mix, 退火延伸一共只有5s。
性格埋下了人生的伏笔~
3楼2012-08-22 14:31:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助,七夕快乐 2012-08-23 15:55:31
228可以试试。
我做过80-400bp的,200多点有的引物还是可以的,但是片段太长PCR效率就有点低,并且有非特异PEAK, 我一般用60度退火,但是提高温度到65度,可以减少或者消除非特异PEAK.
具体条件不能完全根据报道,具体情况具体分析,不过个人觉得,100-200左右的就很好。如果你的228效果不好,可以试试重新设计引物把目标片段定于150bp左右。
4楼2012-08-22 20:18:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助,七夕快乐 2012-08-23 15:55:52
我用的条件是,
     95度 1分钟,
45 X  95度 15秒
     65度 (具体温度需要自己调整,我用的是65,他人可能一般用60度) 45秒
最后是MELT CUVE,
        95度   15秒
     65度   45秒
     95度   15秒
5楼2012-08-22 20:20:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

czcpudai

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by mutou1025 at 2012-08-22 13:25:33
一般在100bp左右,重新设计引物。你的300多bp太大了。SYBR我记得程序变形退火时间 好像比普通PCR时间短。太大了会不会没有完全P出来啊

哦 谢谢哈!
6楼2012-08-23 14:29:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

czcpudai

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by chenguestc at 2012-08-22 20:18:01
228可以试试。
我做过80-400bp的,200多点有的引物还是可以的,但是片段太长PCR效率就有点低,并且有非特异PEAK, 我一般用60度退火,但是提高温度到65度,可以减少或者消除非特异PEAK.
具体条件不能完全根据报道, ...

恩,非常感谢!我觉得您说的挺对的,只是引物要跨外显子设计,自己设计了一下但是没有找到合适的,要么特异性低,要么Tm值相差超过2度,还是仔细再找找吧
7楼2012-08-23 14:36:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

czcpudai

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by chenguestc at 2012-08-22 20:20:35
我用的条件是,
     95度 1分钟,
45 X  95度 15秒
     65度 (具体温度需要自己调整,我用的是65,他人可能一般用60度) 45秒
最后是MELT CUVE,
        95度   15秒
     65度   45秒
     95度   15秒

借鉴了!
8楼2012-08-23 14:37:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

阿菁

新虫 (小有名气)

本帖内容被屏蔽

9楼2012-11-01 12:01:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dayulee

木虫 (正式写手)

愚木虫

【答案】应助回帖

你们设计荧光的引物是用什么软件设计啊
好好学习,天天向上
10楼2012-12-03 11:34:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 czcpudai 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿北交大材料工程总分358求调剂 +4 cs0106 2026-04-05 4/200 2026-04-05 13:25 by jp9609
[考研] 295求调剂 +10 xndjjj 2026-04-04 10/500 2026-04-05 11:19 by 猪会飞
[考研] 312求调剂 +3 Say Never 2026-04-04 3/150 2026-04-05 11:19 by guoweigw
[考研] 材料调剂 +9 革微桂 2026-04-04 9/450 2026-04-05 08:27 by 544594351
[考研] 322求调剂:一志愿湖南大学 材料与化工(085600),已过六级。 +16 XX小邓 2026-03-29 18/900 2026-04-05 08:20 by gaoxiaoniuma
[考研] 311分 22408 求调剂 +3 bing_bot 2026-04-03 3/150 2026-04-05 00:43 by chongya
[考研] 280求调剂 +3 李rien 2026-04-04 3/150 2026-04-04 23:32 by lqwchd
[考研] 290求调剂 +7 luoziheng 2026-04-04 7/350 2026-04-04 23:17 by lqwchd
[考研] 材料调剂 +11 一样YWY 2026-04-02 13/650 2026-04-04 23:10 by 无际的草原
[考研] 调剂 +11 JLLLLLLLLLL 2026-04-03 11/550 2026-04-04 22:21 by hemengdong
[考研] 一志愿华中农业071010,总分320求调剂 +7 困困困困坤坤 2026-04-02 7/350 2026-04-03 17:26 by Yuena_Wang
[考研] 专硕085601求调剂 +7 suyifei 2026-04-03 8/400 2026-04-03 14:00 by 欣喜777
[考研] 一志愿南开大学0710生物学359求调剂 +6 兔兔兔111223314 2026-03-29 8/400 2026-04-02 22:37 by louise0220
[考研] 22408 266求调剂 +3 masss11222 2026-04-02 3/150 2026-04-02 18:11 by 笔落锦州
[考研] 318求调剂,计算材料方向 +10 吸喵有害笙命 2026-04-01 11/550 2026-04-02 16:29 by oooqiao
[考研] 26考研调剂 +4 Wnz.20030617 2026-04-01 5/250 2026-04-02 16:11 by 1939136013狗壮
[考研] 求调剂推荐 +3 南山南@ 2026-04-01 3/150 2026-04-02 12:09 by xiaoranmu
[考研] 070300化学279求调剂 +15 哈哈哈^_^ 2026-03-31 17/850 2026-04-01 21:37 by 给你你注意休息
[考研] 材料调剂 +11 一样YWY 2026-03-31 11/550 2026-04-01 11:35 by wangjy2002
[硕博家园] 博一被送出联培感觉不适应怎么办 +3 全村的狗 2026-03-31 3/150 2026-04-01 10:44 by 328838485
信息提示
请填处理意见