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hwchen2000金虫 (正式写手)
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[求助]
RT-PCR高手请进
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我现在做RT-PCR多次，只有一次做第二链合成电泳后显示有约1000bp的条带，但是再也没有重复出来，所以想请教一下各位高手 RNA模板约1ug 我的PCR引物是 forwards: 5'-ggatatcATGGCAGCCANAGATGCTTGTATTG-3' rewards: 5'-cccaagcttCTAGAATGCAGCACCAACGAAGGGT-3' （小写为保护碱基） 请大侠帮我验证这个引物的退火温度，我现在是55℃ 求教了！！ |
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 PCR技术 | 分子生化实验经验积累 |
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【答案】应助回帖
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hwchen2000: 金币+5, ★有帮助 2013-01-02 11:08:40
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hwchen2000: 金币+5, ★有帮助 2013-01-02 11:08:40
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RT-PCR即反转录PCR，需要注意的有以下几点： 1、首先看RNA是否完整，一般RNA电泳检测，28S的亮度约是18S的两倍，说明RNA完整，否则会含有其他RNA，比如mRNA，会影响后续逆转； 2、我们做逆转一般用的是Takara的逆转录试剂盒，逆转效果还不错吧。先看你逆转时RNA加的量是否合适，过小或过高都影响逆转效果，再看你逆转的过程是不是有差错； 3、逆转为cDNA后，先用其他常用基因检测下cDNA的质量，比如先扩增actin，一般这个退火温度是确定的，如果结果好再扩增你的目的基因，至少说明模板没问题； 4、能扩出actin基因而扩不出你的目的基因，可以做退火温度梯度，一般我们用这个引物设计软件http://www.sigma-genosys.com/calc/DNAcalc.asp 测出的退火温度-5度都能PCR出结果，除非上下游引物退火温度差距太大 希望对你能有帮助！ |
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hwchen20005楼2012-12-18 17:26:04
zhaodahe
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zhaodahe
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6楼2012-12-21 13:38:56
【答案】应助回帖
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hwchen2000: 金币+10 2013-01-02 11:09:17
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我曾经遇到过与你相同的问题，只是你的目的片段比较大，我觉得最好从以下几个方面考虑： 1.首先一定要保证你的RAN的纯度和完整性都要好，主要是纯度一定要好！这一步是基础。 2.在做RT的时候，可以尝试增大RNA的量，2ug也可以，不过一定要在冰上进行。 3.做PCR这一步的时候，我觉得你最好使用快速高保真酶来扩增，可以用PrimeStar这种酶来扩增，可以先扩增内参看看。这一步我觉得退火温度可能不会是大的问题，主要是酶，体系最好是25ul，不要用50ul的体系。 4.如果一直没有结果的话，没有办法，只有从头再做，保证每一步都是可信的，然后再往下做。 |
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7楼2012-12-21 20:34:51
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
hwchen2000: 金币+5 2013-01-02 11:10:17
hwchen2000: 金币+5 2013-01-02 11:10:17
| 1000bp根本不算大！第一用内参基因扩一下 ，确认模版能用，也确认你的PCR所有试剂能用。第二退火温度用三倍GC+2倍的AT算一下，我感觉退火温度可能太低了。第三，把你出条带那个PCR产物再跑一下，看有没有条带了，如果有，看多亮，太亮的话要稀释的。 |
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8楼2012-12-21 21:52:01
hwchen2000
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9楼2012-12-25 10:06:30
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