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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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hwchen2000

金虫 (正式写手)

[求助] RT-PCR高手请进

我现在做RT-PCR多次，只有一次做第二链合成电泳后显示有约1000bp的条带，但是再也没有重复出来，所以想请教一下各位高手
RNA模板约1ug
我的PCR引物是
forwards: 5'-ggatatcATGGCAGCCANAGATGCTTGTATTG-3'
rewards:  5'-cccaagcttCTAGAATGCAGCACCAACGAAGGGT-3'
（小写为保护碱基）
请大侠帮我验证这个引物的退火温度，我现在是55℃
求教了！！
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1楼 2012-12-18 10:30:05
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czcpudai

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2012-12-22 18:54:18
hwchen2000: 金币+10 2013-01-02 11:09:17
我曾经遇到过与你相同的问题，只是你的目的片段比较大，我觉得最好从以下几个方面考虑：
1.首先一定要保证你的RAN的纯度和完整性都要好，主要是纯度一定要好！这一步是基础。
2.在做RT的时候，可以尝试增大RNA的量，2ug也可以，不过一定要在冰上进行。
3.做PCR这一步的时候，我觉得你最好使用快速高保真酶来扩增，可以用PrimeStar这种酶来扩增，可以先扩增内参看看。这一步我觉得退火温度可能不会是大的问题，主要是酶，体系最好是25ul，不要用50ul的体系。
4.如果一直没有结果的话，没有办法，只有从头再做，保证每一步都是可信的，然后再往下做。
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hwchen2000
7楼2012-12-21 20:34:51
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
hwchen2000: 金币+5 2013-01-02 11:10:46
你要扩增的序列（1K）可能太长了，就是很难。你可以用上次扩增出来的产物做模板，可能效果好一些。
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2楼2012-12-18 12:27:32
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hwchen2000

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-12-18 12:27:32
你要扩增的序列（1K）可能太长了，就是很难。你可以用上次扩增出来的产物做模板，可能效果好一些。

我用上次扩增的产物做第二次PCR，又P不出来，所以想找找原因，包括验证这个引物的退火温度等等
谢谢你的回帖
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3楼2012-12-18 12:32:59
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
hwchen2000: 金币+5 2013-01-02 11:10:32
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-12-18 12:27:32
你要扩增的序列（1K）可能太长了，就是很难。你可以用上次扩增出来的产物做模板，可能效果好一些。

软件计算的退火温度是不准确的，你要怀疑是退火温度的原因，就做个退火温度的梯度看看吧。
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4楼2012-12-18 12:56:11
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