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hwchen2000金虫 (正式写手)
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[求助]
RT-PCR高手请进
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我现在做RT-PCR多次，只有一次做第二链合成电泳后显示有约1000bp的条带，但是再也没有重复出来，所以想请教一下各位高手 RNA模板约1ug 我的PCR引物是 forwards: 5'-ggatatcATGGCAGCCANAGATGCTTGTATTG-3' rewards: 5'-cccaagcttCTAGAATGCAGCACCAACGAAGGGT-3' （小写为保护碱基） 请大侠帮我验证这个引物的退火温度，我现在是55℃ 求教了！！ |
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 PCR技术 | 分子生化实验经验积累 |
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【答案】应助回帖
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gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2012-12-22 18:54:18
hwchen2000: 金币+10 2013-01-02 11:09:17
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2012-12-22 18:54:18
hwchen2000: 金币+10 2013-01-02 11:09:17
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我曾经遇到过与你相同的问题，只是你的目的片段比较大，我觉得最好从以下几个方面考虑： 1.首先一定要保证你的RAN的纯度和完整性都要好，主要是纯度一定要好！这一步是基础。 2.在做RT的时候，可以尝试增大RNA的量，2ug也可以，不过一定要在冰上进行。 3.做PCR这一步的时候，我觉得你最好使用快速高保真酶来扩增，可以用PrimeStar这种酶来扩增，可以先扩增内参看看。这一步我觉得退火温度可能不会是大的问题，主要是酶，体系最好是25ul，不要用50ul的体系。 4.如果一直没有结果的话，没有办法，只有从头再做，保证每一步都是可信的，然后再往下做。 |
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hwchen20007楼2012-12-21 20:34:51
11楼2012-12-25 12:11:43