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hwchen2000

金虫 (正式写手)

[求助] RT-PCR高手请进

我现在做RT-PCR多次,只有一次做第二链合成电泳后显示有约1000bp的条带,但是再也没有重复出来,所以想请教一下各位高手
RNA模板约1ug
我的PCR引物是
forwards: 5'-ggatatcATGGCAGCCANAGATGCTTGTATTG-3'
rewards:  5'-cccaagcttCTAGAATGCAGCACCAACGAAGGGT-3'
(小写为保护碱基)
请大侠帮我验证这个引物的退火温度,我现在是55℃
求教了!!
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hwchen2000

金虫 (正式写手)

送鲜花一朵
引用回帖:
7楼: Originally posted by czcpudai at 2012-12-21 20:34:51
我曾经遇到过与你相同的问题,只是你的目的片段比较大,我觉得最好从以下几个方面考虑:
1.首先一定要保证你的RAN的纯度和完整性都要好,主要是纯度一定要好!这一步是基础。
2.在做RT的时候,可以尝试增大RNA的量 ...

谢谢你的帮助!
1.RNA最大的时候曾经用过2ug的量
2.我用的酶是Taq+pfu,因为是特定木本植物,所以找不到内参可以做
3.我的PCR体系一直用的20ul体系
现在最头疼的是温度从48-63℃都能出现弥散的非特异性扩增
没办法,现在还从头来,像你说的做好每一步再说
9楼2012-12-25 10:06:30
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
hwchen2000: 金币+5 2013-01-02 11:10:46
你要扩增的序列(1K)可能太长了,就是很难。你可以用上次扩增出来的产物做模板,可能效果好一些。
2楼2012-12-18 12:27:32
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hwchen2000

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-12-18 12:27:32
你要扩增的序列(1K)可能太长了,就是很难。你可以用上次扩增出来的产物做模板,可能效果好一些。

我用上次扩增的产物做第二次PCR,又P不出来,所以想找找原因,包括验证这个引物的退火温度等等
谢谢你的回帖
3楼2012-12-18 12:32:59
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
hwchen2000: 金币+5 2013-01-02 11:10:32
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-12-18 12:27:32
你要扩增的序列(1K)可能太长了,就是很难。你可以用上次扩增出来的产物做模板,可能效果好一些。

软件计算的退火温度是不准确的,你要怀疑是退火温度的原因,就做个退火温度的梯度看看吧。
4楼2012-12-18 12:56:11
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