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hwchen2000

金虫 (正式写手)

[求助] RT-PCR高手请进

我现在做RT-PCR多次，只有一次做第二链合成电泳后显示有约1000bp的条带，但是再也没有重复出来，所以想请教一下各位高手
RNA模板约1ug
我的PCR引物是
forwards: 5'-ggatatcATGGCAGCCANAGATGCTTGTATTG-3'
rewards:  5'-cccaagcttCTAGAATGCAGCACCAACGAAGGGT-3'
（小写为保护碱基）
请大侠帮我验证这个引物的退火温度，我现在是55℃
求教了！！
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1楼 2012-12-18 10:30:05
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hwchen2000

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-12-18 12:27:32
你要扩增的序列（1K）可能太长了，就是很难。你可以用上次扩增出来的产物做模板，可能效果好一些。

我用上次扩增的产物做第二次PCR，又P不出来，所以想找找原因，包括验证这个引物的退火温度等等
谢谢你的回帖
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3楼2012-12-18 12:32:59
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
hwchen2000: 金币+5 2013-01-02 11:10:46
你要扩增的序列（1K）可能太长了，就是很难。你可以用上次扩增出来的产物做模板，可能效果好一些。
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2楼2012-12-18 12:27:32
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
hwchen2000: 金币+5 2013-01-02 11:10:32
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-12-18 12:27:32
你要扩增的序列（1K）可能太长了，就是很难。你可以用上次扩增出来的产物做模板，可能效果好一些。

软件计算的退火温度是不准确的，你要怀疑是退火温度的原因，就做个退火温度的梯度看看吧。
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4楼2012-12-18 12:56:11
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牧歌ping

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 感谢应助！ 2012-12-22 18:53:44
hwchen2000: 金币+5, ★有帮助 2013-01-02 11:08:40
RT-PCR即反转录PCR，需要注意的有以下几点：
1、首先看RNA是否完整，一般RNA电泳检测，28S的亮度约是18S的两倍，说明RNA完整，否则会含有其他RNA，比如mRNA，会影响后续逆转；
2、我们做逆转一般用的是Takara的逆转录试剂盒，逆转效果还不错吧。先看你逆转时RNA加的量是否合适，过小或过高都影响逆转效果，再看你逆转的过程是不是有差错；
3、逆转为cDNA后，先用其他常用基因检测下cDNA的质量，比如先扩增actin，一般这个退火温度是确定的，如果结果好再扩增你的目的基因，至少说明模板没问题；
4、能扩出actin基因而扩不出你的目的基因，可以做退火温度梯度，一般我们用这个引物设计软件http://www.sigma-genosys.com/calc/DNAcalc.asp 测出的退火温度-5度都能PCR出结果，除非上下游引物退火温度差距太大
希望对你能有帮助！
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hwchen2000
5楼2012-12-18 17:26:04
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