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hwchen2000金虫 (正式写手)
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[求助]
RT-PCR高手请进
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我现在做RT-PCR多次，只有一次做第二链合成电泳后显示有约1000bp的条带，但是再也没有重复出来，所以想请教一下各位高手 RNA模板约1ug 我的PCR引物是 forwards: 5'-ggatatcATGGCAGCCANAGATGCTTGTATTG-3' rewards: 5'-cccaagcttCTAGAATGCAGCACCAACGAAGGGT-3' （小写为保护碱基） 请大侠帮我验证这个引物的退火温度，我现在是55℃ 求教了！！ |
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 PCR技术 | 分子生化实验经验积累 |
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hwchen2000
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3楼2012-12-18 12:32:59
zhaodahe
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4楼2012-12-18 12:56:11
【答案】应助回帖
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RT-PCR即反转录PCR，需要注意的有以下几点： 1、首先看RNA是否完整，一般RNA电泳检测，28S的亮度约是18S的两倍，说明RNA完整，否则会含有其他RNA，比如mRNA，会影响后续逆转； 2、我们做逆转一般用的是Takara的逆转录试剂盒，逆转效果还不错吧。先看你逆转时RNA加的量是否合适，过小或过高都影响逆转效果，再看你逆转的过程是不是有差错； 3、逆转为cDNA后，先用其他常用基因检测下cDNA的质量，比如先扩增actin，一般这个退火温度是确定的，如果结果好再扩增你的目的基因，至少说明模板没问题； 4、能扩出actin基因而扩不出你的目的基因，可以做退火温度梯度，一般我们用这个引物设计软件http://www.sigma-genosys.com/calc/DNAcalc.asp 测出的退火温度-5度都能PCR出结果，除非上下游引物退火温度差距太大 希望对你能有帮助！ |
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hwchen20005楼2012-12-18 17:26:04
