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czcpudai

铜虫 (正式写手)

[求助] 有关RT-PCR模板RNA量的问题,请高手解答!!!

各位RT高手,本人在最近在做rt-PCR,分为三个组,一个是空白组,一个是模型组,一个是药物组,想做半定量RT-PCR看看药物在分子水平的作用机制,当做rt-pcr的时候,是不是模板量要加入一样???所谓的模板量到底是指模板的体积量(ul)还是模板的质量(ug)呢????有文献中提到“Equivalent amounts of mRNA were used for the reaction with reverse transcriptase”,指的是加入定量体积的mRNA还是定量ug的mRNA呢??求高手解答!!谢谢!!
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xw19880905

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-09-11 15:56:06
理论上说,模版量相同是指ug的相同,但是一般我们提取RNA的标准是一致的,加入的DEPC水的量也是一定的,所以做半定量时加入相同体积的的模板就行,此外,有内参基因作为参照,也可以减小系统误差。做半定量时其他条件和普通PCR差不多,但在循环数上特别注意,循环数过多容易饱和,不易分辨,一般要找好这个循环数,最小循环能跑出产物。另建议坐定量效果比半定量好多了
7楼2012-09-11 10:50:22
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普通回帖

小小技术官

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-11 15:55:53
rt-pcr不同组间比较时,要量一致,理论上指模版分子量,即数目。但实验中很难平衡,而是使用内参来平衡模板量,常用的内参是,beta-action和tubulin。内参调整一致后,就可以比较各组间的差异了。
生活是一面镜子,要笑着面对!
2楼2012-09-07 21:00:41
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czcpudai

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 小小技术官 at 2012-09-07 21:00:41
rt-pcr不同组间比较时,要量一致,理论上指模版分子量,即数目。但实验中很难平衡,而是使用内参来平衡模板量,常用的内参是,beta-action和tubulin。内参调整一致后,就可以比较各组间的差异了。

恩  有道理!明白了,非常感谢!
3楼2012-09-08 11:43:14
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czcpudai

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 小小技术官 at 2012-09-07 21:00:41
rt-pcr不同组间比较时,要量一致,理论上指模版分子量,即数目。但实验中很难平衡,而是使用内参来平衡模板量,常用的内参是,beta-action和tubulin。内参调整一致后,就可以比较各组间的差异了。

您好,我还想问一下,要想做半定量rt-pcr的话,有那几个条件需要摸清楚???  我现在考虑的是RT反应的模板的浓度(前提是模板质量和纯度都好),PCR的循环的数目,其中Mg离子浓度都是按照buffer中来的,没有调节,谢谢解答!
4楼2012-09-10 09:50:37
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小小技术官

木虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by czcpudai at 2012-09-10 09:50:37
您好,我还想问一下,要想做半定量rt-pcr的话,有那几个条件需要摸清楚???  我现在考虑的是RT反应的模板的浓度(前提是模板质量和纯度都好),PCR的循环的数目,其中Mg离子浓度都是按照buffer中来的,没有调节,谢 ...

不好意思。具体的实验我还没有操作,我还停留在理论方面。恕不能帮你解答。实在抱歉,建议你多看点这方面的书,论坛上的解答只能供参考的。
生活是一面镜子,要笑着面对!
5楼2012-09-10 10:20:31
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junminh

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
dNTP浓度,MG离子浓度(可以再额外加),引物浓度,探针浓度,TM值及时间都需要摸索的。跟PCR差不多了,
6楼2012-09-10 10:36:03
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czcpudai

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by xw19880905 at 2012-09-11 10:50:22
理论上说,模版量相同是指ug的相同,但是一般我们提取RNA的标准是一致的,加入的DEPC水的量也是一定的,所以做半定量时加入相同体积的的模板就行,此外,有内参基因作为参照,也可以减小系统误差。做半定量时其他条 ...

,我是先做半定量看看效果,然后再做定量的,谢谢了!
8楼2012-09-13 09:08:44
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xw19880905

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by xw19880905 at 2012-09-11 10:50:22
理论上说,模版量相同是指ug的相同,但是一般我们提取RNA的标准是一致的,加入的DEPC水的量也是一定的,所以做半定量时加入相同体积的的模板就行,此外,有内参基因作为参照,也可以减小系统误差。做半定量时其他条 ...

半定量主要就是循环数把握好,如果你做的基因表达量较高,30左右循环差不多
9楼2012-09-13 09:50:56
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czcpudai

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
9楼: Originally posted by xw19880905 at 2012-09-13 09:50:56
半定量主要就是循环数把握好,如果你做的基因表达量较高,30左右循环差不多...

差不多吧,还是做个循环数的梯度看看吧,30个循环可能有点多了
10楼2012-09-13 15:12:37
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