应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 病毒RNA提取后做RT-PCR
141/2返回列表12下一页
查看: 2103  |  回复: 13
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

Joannena

新虫 (初入文坛)

[求助] 病毒RNA提取后做RT-PCR

求助：病毒RNA提取后做RT-PCR后有时目的条带特别浅，有时根本P不出来？求高手指点?
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2011-08-07 22:07:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

adslye

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
Joannena(金币+1): 谢谢你，我也考虑是RNA的问题，但是提了几遍都是这样，可能还是细节注意不够吧。我再试试 2011-08-09 23:20:23
silicare(金币+3): 2011-08-10 12:00:07
1.用别的，肯定能P出来的基因进行PCR，确认cDNA没问题。
2.确定RNA没问题。跑个胶看看条带完整性，测下OD比值是否在1.9左右。
3.确认反转录没问题。这步可以拿别的RNA样品做个对照。比较麻烦，一般也不会有问题。可以最后排除。
4.问你身边的师兄师姐。这是个小实验，如果你是新手，可能是不小心操作的问题。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-08-08 08:07:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

博杰冲

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你先测一下你RNA的含量。做pcr是调整一下模板的含量。
赞一下 回复此楼
3楼2011-08-08 09:46:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dianaofyezi

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

加入RNase抑制剂防止降解，其他就是注意下小的操作细节。
赞一下 回复此楼
52187644
4楼2011-08-09 15:20:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dianaofyezi

金虫 (正式写手)
或者看下该RNA的丰度是不是本来就很低。
赞一下 回复此楼
52187644
5楼2011-08-09 15:21:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

muchong5577

金虫 (正式写手)
楼主，说明下你的RNA是怎么提取的
赞一下 回复此楼
6楼2011-08-09 16:01:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cloverplm

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
silicare(金币+3): 鼓励新虫发帖交流 2011-08-10 12:00:26
1. RNA 提取的步骤相当关键， 细节一定要注意，比如勤换手套啊， 裂解时一定要剧烈振荡等等
2. 测模板的OD评价下你提取的好不好
3. 可以根据模板来源的物种不同，选择不同的逆转录酶
4. PCR的条件好好摸索
5. 根据目的条带大小选择合适的胶浓度与电泳时间、电压
反正都是细节，detail is everything.
赞一下(1人) 回复此楼
净——静——竞——进
7楼2011-08-09 20:45:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Joannena

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by muchong5577 at 2011-08-09 16:01:35:
楼主，说明下你的RNA是怎么提取的

谢谢!病毒RNA的提取过程:
     250μL病毒液+750μLTrizol 混匀震荡,静止5min;+200μL氯仿-异戊醇混匀，静置5min，12000r,4℃,15min；取上清，加同体积异丙醇，混匀，液氮沉降2min，13500r,4℃,20min；弃上清，75%冷乙醇洗一次，弃上清，倒置晾干，加10μLDEPC水溶解RNA。
      马上做逆转录：
            RNA               9μL
            RNA酶抑制剂    1μL
            5Buffer            4μL
            dNTP               4μL
            逆转录酶（M）  1μL
            引物                1μL
     总体积20μL，37℃   1小时既得cDNA
赞一下 回复此楼
8楼2011-08-10 00:04:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Joannena

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by cloverplm at 2011-08-09 20:45:27:
1. RNA 提取的步骤相当关键， 细节一定要注意，比如勤换手套啊， 裂解时一定要剧烈振荡等等
2. 测模板的OD评价下你提取的好不好
3. 可以根据模板来源的物种不同，选择不同的逆转录酶
4. PCR的条件好好摸索
5. ...

谢谢各位高手的帮助,我会注意一下大家提出的建议的.非常感谢!
赞一下 回复此楼
9楼2011-08-10 00:07:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

muchong5577

金虫 (正式写手)
提取RNA中使用的有机溶剂预冷下再使用会不会好点？我只是猜想，自己没做过。
赞一下 回复此楼
10楼2011-08-10 09:52:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 Joannena 的主题更新
141/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 会评 +5 无名者登山 2026-07-15 5/250 2026-07-15 18:15 by 杠就是你对
[基金申请] 生生命学部会评 +3 wuke100666 2026-07-15 3/150 2026-07-15 17:11 by kingkocxr
[基金申请] 小木虫没落了，除了祈祷帖子，几乎看不到有价值的帖子 +13 botar 2026-07-14 13/650 2026-07-15 17:08 by kingkocxr
[基金申请] E口会评 +11 布布和一二 2026-07-13 13/650 2026-07-15 16:34 by Kittylucky
[基金申请] E口青C会评结束了吗？ 40+3 小小书虫c 2026-07-14 9/450 2026-07-15 16:04 by 安静的知了
[基金申请] 生命口C13面上会评时间 +6 luckinging 2026-07-14 9/450 2026-07-15 14:39 by 雨冰共舞
[教师之家] 内心匮乏 +13 水冰月月野兔 2026-07-12 13/650 2026-07-15 14:21 by jiduquegai
[文学芳草园] 你可曾有过这种感受？ +3 Jeanya 2026-07-09 6/300 2026-07-15 11:07 by mbtwt
[论文投稿] 农业机械学报投稿周期 +3 G0DLIN 2026-07-14 7/350 2026-07-15 09:26 by xs74101122
[基金申请] 国自然面上D口祈祷 +4 monkeynana 2026-07-14 4/200 2026-07-15 09:14 by 白水煮
[论文投稿] 跨出版社商投稿 20+4 倪好520 2026-07-13 4/200 2026-07-15 08:35 by bobvan
[基金申请] 没收到消息，再次陪跑 +3 天空星辰fly 2026-07-14 3/150 2026-07-14 19:14 by 6543yes
[基金申请] 不要再数国自然申请书的 filecode 的分隔符个数了 +13 sadpencil 2026-07-12 20/1000 2026-07-14 13:12 by 杠就是你对
[基金申请] 明天E口面上会评 +8 布布和一二 2026-07-12 9/450 2026-07-13 22:59 by QTSorange
[论文投稿] MSER送审了还被拒稿 +4 S778950906 2026-07-08 6/300 2026-07-13 16:22 by tfang
[基金申请] 祈祷青基必中 50+6 hadengry 2026-07-09 16/800 2026-07-12 20:31 by 登山虫虫
[考博] 27届辽宁大学应届毕业生申博 +3 可乐微风大海 2026-07-09 3/150 2026-07-10 21:23 by 贪玩的研究僧
[基金申请] 关于如何从代码看上不上会 +17 且听虎啸 2026-07-09 23/1150 2026-07-10 19:51 by sdfapple719
[有机交流] chemdraw 20+5 ?慕鱼? 2026-07-08 6/300 2026-07-10 15:37 by 紫枫星域
[基金申请] b口会评 +6 当空照 2026-07-08 6/300 2026-07-09 20:49 by tonyliu0401
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭