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Joannena

新虫 (初入文坛)

[求助] 病毒RNA提取后做RT-PCR

求助:病毒RNA提取后做RT-PCR后有时目的条带特别浅,有时根本P不出来?求高手指点?
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Joannena

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by muchong5577 at 2011-08-09 16:01:35:
楼主,说明下你的RNA是怎么提取的

谢谢!病毒RNA的提取过程:
     250μL病毒液+750μLTrizol 混匀震荡,静止5min;+200μL氯仿-异戊醇混匀,静置5min,12000r,4℃,15min;取上清,加同体积异丙醇,混匀,液氮沉降2min,13500r,4℃,20min;弃上清,75%冷乙醇洗一次,弃上清,倒置晾干,加10μLDEPC水溶解RNA。
      马上做逆转录:
            RNA               9μL
            RNA酶抑制剂    1μL
            5Buffer            4μL
            dNTP               4μL
            逆转录酶(M)  1μL
            引物                1μL
     总体积20μL,37℃   1小时既得cDNA
8楼2011-08-10 00:04:08
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查看全部 14 个回答

adslye

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
Joannena(金币+1): 谢谢你,我也考虑是RNA的问题,但是提了几遍都是这样,可能还是细节注意不够吧。我再试试 2011-08-09 23:20:23
silicare(金币+3): 2011-08-10 12:00:07
1.用别的,肯定能P出来的基因进行PCR,确认cDNA没问题。
2.确定RNA没问题。跑个胶看看条带完整性,测下OD比值是否在1.9左右。
3.确认反转录没问题。这步可以拿别的RNA样品做个对照。比较麻烦,一般也不会有问题。可以最后排除。
4.问你身边的师兄师姐。这是个小实验,如果你是新手,可能是不小心操作的问题。
2楼2011-08-08 08:07:23
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博杰冲

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你先测一下你RNA的含量。做pcr是调整一下模板的含量。
3楼2011-08-08 09:46:11
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dianaofyezi

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

加入RNase抑制剂防止降解,其他就是注意下小的操作细节。
52187644
4楼2011-08-09 15:20:35
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