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Joannena

新虫 (初入文坛)

[求助] 病毒RNA提取后做RT-PCR

求助:病毒RNA提取后做RT-PCR后有时目的条带特别浅,有时根本P不出来?求高手指点?
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cloverplm

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
silicare(金币+3): 鼓励新虫发帖交流 2011-08-10 12:00:26
1. RNA 提取的步骤相当关键, 细节一定要注意,比如勤换手套啊, 裂解时一定要剧烈振荡等等
2. 测模板的OD评价下你提取的好不好
3. 可以根据模板来源的物种不同,选择不同的逆转录酶
4. PCR的条件好好摸索
5. 根据目的条带大小选择合适的胶浓度与电泳时间、电压
反正都是细节,detail is everything.
净——静——竞——进
7楼2011-08-09 20:45:27
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查看全部 14 个回答

adslye

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
Joannena(金币+1): 谢谢你,我也考虑是RNA的问题,但是提了几遍都是这样,可能还是细节注意不够吧。我再试试 2011-08-09 23:20:23
silicare(金币+3): 2011-08-10 12:00:07
1.用别的,肯定能P出来的基因进行PCR,确认cDNA没问题。
2.确定RNA没问题。跑个胶看看条带完整性,测下OD比值是否在1.9左右。
3.确认反转录没问题。这步可以拿别的RNA样品做个对照。比较麻烦,一般也不会有问题。可以最后排除。
4.问你身边的师兄师姐。这是个小实验,如果你是新手,可能是不小心操作的问题。
2楼2011-08-08 08:07:23
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博杰冲

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你先测一下你RNA的含量。做pcr是调整一下模板的含量。
3楼2011-08-08 09:46:11
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dianaofyezi

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

加入RNase抑制剂防止降解,其他就是注意下小的操作细节。
52187644
4楼2011-08-09 15:20:35
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