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Joannena

新虫 (初入文坛)

[求助] 病毒RNA提取后做RT-PCR

求助：病毒RNA提取后做RT-PCR后有时目的条带特别浅，有时根本P不出来？求高手指点?
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1楼2011-08-07 22:07:47
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adslye

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
Joannena(金币+1): 谢谢你，我也考虑是RNA的问题，但是提了几遍都是这样，可能还是细节注意不够吧。我再试试 2011-08-09 23:20:23
silicare(金币+3): 2011-08-10 12:00:07
1.用别的，肯定能P出来的基因进行PCR，确认cDNA没问题。
2.确定RNA没问题。跑个胶看看条带完整性，测下OD比值是否在1.9左右。
3.确认反转录没问题。这步可以拿别的RNA样品做个对照。比较麻烦，一般也不会有问题。可以最后排除。
4.问你身边的师兄师姐。这是个小实验，如果你是新手，可能是不小心操作的问题。
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2楼2011-08-08 08:07:23
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博杰冲

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你先测一下你RNA的含量。做pcr是调整一下模板的含量。
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3楼2011-08-08 09:46:11
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dianaofyezi

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

加入RNase抑制剂防止降解，其他就是注意下小的操作细节。
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52187644
4楼2011-08-09 15:20:35
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dianaofyezi

金虫 (正式写手)
或者看下该RNA的丰度是不是本来就很低。
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52187644
5楼2011-08-09 15:21:10
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muchong5577

金虫 (正式写手)
楼主，说明下你的RNA是怎么提取的
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6楼2011-08-09 16:01:35
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cloverplm

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
silicare(金币+3): 鼓励新虫发帖交流 2011-08-10 12:00:26
1. RNA 提取的步骤相当关键， 细节一定要注意，比如勤换手套啊， 裂解时一定要剧烈振荡等等
2. 测模板的OD评价下你提取的好不好
3. 可以根据模板来源的物种不同，选择不同的逆转录酶
4. PCR的条件好好摸索
5. 根据目的条带大小选择合适的胶浓度与电泳时间、电压
反正都是细节，detail is everything.
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净——静——竞——进
7楼2011-08-09 20:45:27
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Joannena

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by muchong5577 at 2011-08-09 16:01:35:
楼主，说明下你的RNA是怎么提取的

谢谢!病毒RNA的提取过程:
     250μL病毒液+750μLTrizol 混匀震荡,静止5min;+200μL氯仿-异戊醇混匀，静置5min，12000r,4℃,15min；取上清，加同体积异丙醇，混匀，液氮沉降2min，13500r,4℃,20min；弃上清，75%冷乙醇洗一次，弃上清，倒置晾干，加10μLDEPC水溶解RNA。
      马上做逆转录：
            RNA               9μL
            RNA酶抑制剂    1μL
            5Buffer            4μL
            dNTP               4μL
            逆转录酶（M）  1μL
            引物                1μL
     总体积20μL，37℃   1小时既得cDNA
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8楼2011-08-10 00:04:08
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Joannena

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by cloverplm at 2011-08-09 20:45:27:
1. RNA 提取的步骤相当关键， 细节一定要注意，比如勤换手套啊， 裂解时一定要剧烈振荡等等
2. 测模板的OD评价下你提取的好不好
3. 可以根据模板来源的物种不同，选择不同的逆转录酶
4. PCR的条件好好摸索
5. ...

谢谢各位高手的帮助,我会注意一下大家提出的建议的.非常感谢!
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9楼2011-08-10 00:07:48
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muchong5577

金虫 (正式写手)
提取RNA中使用的有机溶剂预冷下再使用会不会好点？我只是猜想，自己没做过。
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10楼2011-08-10 09:52:06
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