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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 有关RT-PCR模板RNA量的问题，请高手解答！！！
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czcpudai

铜虫 (正式写手)

[求助] 有关RT-PCR模板RNA量的问题，请高手解答！！！

各位RT高手，本人在最近在做rt-PCR，分为三个组，一个是空白组，一个是模型组，一个是药物组，想做半定量RT-PCR看看药物在分子水平的作用机制，当做rt-pcr的时候，是不是模板量要加入一样？？？所谓的模板量到底是指模板的体积量（ul）还是模板的质量（ug）呢？？？？有文献中提到“Equivalent amounts of mRNA were used for the reaction with reverse transcriptase”，指的是加入定量体积的mRNA还是定量ug的mRNA呢？？求高手解答！！谢谢！！
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1楼 2012-09-07 20:11:37
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

xw19880905

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-09-11 15:56:06
理论上说，模版量相同是指ug的相同，但是一般我们提取RNA的标准是一致的，加入的DEPC水的量也是一定的，所以做半定量时加入相同体积的的模板就行，此外，有内参基因作为参照，也可以减小系统误差。做半定量时其他条件和普通PCR差不多，但在循环数上特别注意，循环数过多容易饱和，不易分辨，一般要找好这个循环数，最小循环能跑出产物。另建议坐定量效果比半定量好多了
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7楼2012-09-11 10:50:22
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普通回帖

小小技术官

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-11 15:55:53
rt-pcr不同组间比较时，要量一致，理论上指模版分子量，即数目。但实验中很难平衡，而是使用内参来平衡模板量，常用的内参是，beta-action和tubulin。内参调整一致后，就可以比较各组间的差异了。
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生活是一面镜子，要笑着面对！
2楼2012-09-07 21:00:41
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小小技术官 at 2012-09-07 21:00:41
rt-pcr不同组间比较时，要量一致，理论上指模版分子量，即数目。但实验中很难平衡，而是使用内参来平衡模板量，常用的内参是，beta-action和tubulin。内参调整一致后，就可以比较各组间的差异了。

恩  有道理！明白了，非常感谢！
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3楼2012-09-08 11:43:14
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小小技术官 at 2012-09-07 21:00:41
rt-pcr不同组间比较时，要量一致，理论上指模版分子量，即数目。但实验中很难平衡，而是使用内参来平衡模板量，常用的内参是，beta-action和tubulin。内参调整一致后，就可以比较各组间的差异了。

您好，我还想问一下，要想做半定量rt-pcr的话，有那几个条件需要摸清楚？？？  我现在考虑的是RT反应的模板的浓度(前提是模板质量和纯度都好)，PCR的循环的数目，其中Mg离子浓度都是按照buffer中来的，没有调节，谢谢解答！
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4楼2012-09-10 09:50:37
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小小技术官

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by czcpudai at 2012-09-10 09:50:37
您好，我还想问一下，要想做半定量rt-pcr的话，有那几个条件需要摸清楚？？？  我现在考虑的是RT反应的模板的浓度(前提是模板质量和纯度都好)，PCR的循环的数目，其中Mg离子浓度都是按照buffer中来的，没有调节，谢 ...

不好意思。具体的实验我还没有操作，我还停留在理论方面。恕不能帮你解答。实在抱歉，建议你多看点这方面的书，论坛上的解答只能供参考的。
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5楼2012-09-10 10:20:31
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junminh

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
dNTP浓度，MG离子浓度（可以再额外加），引物浓度，探针浓度，TM值及时间都需要摸索的。跟PCR差不多了，
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6楼2012-09-10 10:36:03
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by xw19880905 at 2012-09-11 10:50:22
理论上说，模版量相同是指ug的相同，但是一般我们提取RNA的标准是一致的，加入的DEPC水的量也是一定的，所以做半定量时加入相同体积的的模板就行，此外，有内参基因作为参照，也可以减小系统误差。做半定量时其他条 ...

,我是先做半定量看看效果，然后再做定量的，谢谢了！
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8楼2012-09-13 09:08:44
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xw19880905

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by xw19880905 at 2012-09-11 10:50:22
理论上说，模版量相同是指ug的相同，但是一般我们提取RNA的标准是一致的，加入的DEPC水的量也是一定的，所以做半定量时加入相同体积的的模板就行，此外，有内参基因作为参照，也可以减小系统误差。做半定量时其他条 ...

半定量主要就是循环数把握好，如果你做的基因表达量较高，30左右循环差不多
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9楼2012-09-13 09:50:56
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by xw19880905 at 2012-09-13 09:50:56
半定量主要就是循环数把握好，如果你做的基因表达量较高，30左右循环差不多...

差不多吧，还是做个循环数的梯度看看吧，30个循环可能有点多了
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10楼2012-09-13 15:12:37
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