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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 有关RT-PCR模板RNA量的问题，请高手解答！！！
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xw19880905

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by xw19880905 at 2012-09-13 09:50:56
半定量主要就是循环数把握好，如果你做的基因表达量较高，30左右循环差不多...

我做的小鼠大鼠的，actin一般二十个循环左右就出来了，有的基因要40个循环
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11楼2012-09-13 15:17:53
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by xw19880905 at 2012-09-13 09:50:56
半定量主要就是循环数把握好，如果你做的基因表达量较高，30左右循环差不多...

你好，我想请教一下，我昨晚上做的rt，几天做的pcr，跑胶后结果没有目的条带，在下面能看到明显的引物，但是内参还是可以扩出来的，我想问一下是我的模板有问题还是别的原因？？以前就直接出来了，最近一直做却没有结果，是不是引物用的时间长了？酶是最近买的，应该没事，请教一下原因？？
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12楼2012-09-14 13:54:22
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xw19880905

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-14 16:30:52
你的内参基因都可以扩出来，并且很好就说明反转的很好，就不是模版问题。你说以前就可以P出来，引物以前也没问题，可能是你的引物放久了，我也曾遇到过这样的问题，建议你重新稀释引物试试。
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13楼2012-09-14 15:18:06
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by xw19880905 at 2012-09-14 15:18:06
你的内参基因都可以扩出来，并且很好就说明反转的很好，就不是模版问题。你说以前就可以P出来，引物以前也没问题，可能是你的引物放久了，我也曾遇到过这样的问题，建议你重新稀释引物试试。

内参扩增出来我觉得并不是cDNA就很好，因为我是使用的随机引物做RT，那么可能丰富高的就容易出来。我还是试一试引物的问题吧，最大的可能还是模板RNA出了问题
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14楼2012-09-16 08:32:21
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mamadexiao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
小丹木木: 金币+4, 鼓励交流经验 2012-09-17 13:42:59
我做RT的时候，是这样的
首先，把处理和对照组的RNA都定个量，一般2ug反转成cDNA，然后再做PCR
做PCR的时候，做目的基因和内参基因。
PCR体系一致，机子也尽量用一台
加入的cDNA的量也要一致
尽量跑在一块胶上，这样EB的量几乎也是一致的。。。
反正，就是要你从各个方面尽量保持一致，只有处理的不同就行。
另外，RT-PCR的时候，循环数是恨重要的。。。一旦达到扩增平台期，就没啥实质的差异了。。。
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15楼2012-09-16 11:04:32
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by mamadexiao at 2012-09-16 11:04:32
我做RT的时候，是这样的
首先，把处理和对照组的RNA都定个量，一般2ug反转成cDNA，然后再做PCR
做PCR的时候，做目的基因和内参基因。
PCR体系一致，机子也尽量用一台
加入的cDNA的量也要一致
尽量跑在一块胶上 ...

谢谢！我做的时候是先取出2ul的RNA做反转录，然后才测得浓度，结果OD260和OD280的比值为2.1，OD260和OD230的比值为1.8，计算了一下，取2ul的量是2.7ug，但是染色的时候是用了Goldenview，出来了一个很奇怪的现象，跑完电泳的时候在胶上肉眼就可以看到Goldenview的条带，这个条带里面就包含了DNA，搞不明白什么原因，望请教一下！！
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16楼2012-09-16 21:34:02
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mamadexiao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你有没有看这个染色剂的说明啊
你跑电泳的时候，LOADING BUFFER里面肯定有溴酚蓝啊，这类的指示剂吧
你在可见光下看到的带是指示剂啦
你要在紫外下看你的DNA和你的特异性染料Goldenview的结合情况好吧
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17楼2012-09-18 22:58:52
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