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czcpudai

铜虫 (正式写手)

[求助] 有关RT-PCR模板RNA量的问题,请高手解答!!!

各位RT高手,本人在最近在做rt-PCR,分为三个组,一个是空白组,一个是模型组,一个是药物组,想做半定量RT-PCR看看药物在分子水平的作用机制,当做rt-pcr的时候,是不是模板量要加入一样???所谓的模板量到底是指模板的体积量(ul)还是模板的质量(ug)呢????有文献中提到“Equivalent amounts of mRNA were used for the reaction with reverse transcriptase”,指的是加入定量体积的mRNA还是定量ug的mRNA呢??求高手解答!!谢谢!!
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czcpudai

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
15楼: Originally posted by mamadexiao at 2012-09-16 11:04:32
我做RT的时候,是这样的
首先,把处理和对照组的RNA都定个量,一般2ug反转成cDNA,然后再做PCR
做PCR的时候,做目的基因和内参基因。
PCR体系一致,机子也尽量用一台
加入的cDNA的量也要一致
尽量跑在一块胶上 ...

谢谢!我做的时候是先取出2ul的RNA做反转录,然后才测得浓度,结果OD260和OD280的比值为2.1,OD260和OD230的比值为1.8,计算了一下,取2ul的量是2.7ug,但是染色的时候是用了Goldenview,出来了一个很奇怪的现象,跑完电泳的时候在胶上肉眼就可以看到Goldenview的条带,这个条带里面就包含了DNA,搞不明白什么原因,望请教一下!!
16楼2012-09-16 21:34:02
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小小技术官

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-11 15:55:53
rt-pcr不同组间比较时,要量一致,理论上指模版分子量,即数目。但实验中很难平衡,而是使用内参来平衡模板量,常用的内参是,beta-action和tubulin。内参调整一致后,就可以比较各组间的差异了。
生活是一面镜子,要笑着面对!
2楼2012-09-07 21:00:41
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czcpudai

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 小小技术官 at 2012-09-07 21:00:41
rt-pcr不同组间比较时,要量一致,理论上指模版分子量,即数目。但实验中很难平衡,而是使用内参来平衡模板量,常用的内参是,beta-action和tubulin。内参调整一致后,就可以比较各组间的差异了。

恩  有道理!明白了,非常感谢!
3楼2012-09-08 11:43:14
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czcpudai

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 小小技术官 at 2012-09-07 21:00:41
rt-pcr不同组间比较时,要量一致,理论上指模版分子量,即数目。但实验中很难平衡,而是使用内参来平衡模板量,常用的内参是,beta-action和tubulin。内参调整一致后,就可以比较各组间的差异了。

您好,我还想问一下,要想做半定量rt-pcr的话,有那几个条件需要摸清楚???  我现在考虑的是RT反应的模板的浓度(前提是模板质量和纯度都好),PCR的循环的数目,其中Mg离子浓度都是按照buffer中来的,没有调节,谢谢解答!
4楼2012-09-10 09:50:37
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