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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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hwchen2000

金虫 (正式写手)

[求助] RT-PCR高手请进

我现在做RT-PCR多次，只有一次做第二链合成电泳后显示有约1000bp的条带，但是再也没有重复出来，所以想请教一下各位高手
RNA模板约1ug
我的PCR引物是
forwards: 5'-ggatatcATGGCAGCCANAGATGCTTGTATTG-3'
rewards:  5'-cccaagcttCTAGAATGCAGCACCAACGAAGGGT-3'
（小写为保护碱基）
请大侠帮我验证这个引物的退火温度，我现在是55℃
求教了！！
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1楼 2012-12-18 10:30:05
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

牧歌ping

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 感谢应助！ 2012-12-22 18:53:44
hwchen2000: 金币+5, ★有帮助 2013-01-02 11:08:40
RT-PCR即反转录PCR，需要注意的有以下几点：
1、首先看RNA是否完整，一般RNA电泳检测，28S的亮度约是18S的两倍，说明RNA完整，否则会含有其他RNA，比如mRNA，会影响后续逆转；
2、我们做逆转一般用的是Takara的逆转录试剂盒，逆转效果还不错吧。先看你逆转时RNA加的量是否合适，过小或过高都影响逆转效果，再看你逆转的过程是不是有差错；
3、逆转为cDNA后，先用其他常用基因检测下cDNA的质量，比如先扩增actin，一般这个退火温度是确定的，如果结果好再扩增你的目的基因，至少说明模板没问题；
4、能扩出actin基因而扩不出你的目的基因，可以做退火温度梯度，一般我们用这个引物设计软件http://www.sigma-genosys.com/calc/DNAcalc.asp 测出的退火温度-5度都能PCR出结果，除非上下游引物退火温度差距太大
希望对你能有帮助！
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hwchen2000
5楼2012-12-18 17:26:04
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普通回帖

zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
hwchen2000: 金币+5 2013-01-02 11:10:46
你要扩增的序列（1K）可能太长了，就是很难。你可以用上次扩增出来的产物做模板，可能效果好一些。
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2楼2012-12-18 12:27:32
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hwchen2000

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-12-18 12:27:32
你要扩增的序列（1K）可能太长了，就是很难。你可以用上次扩增出来的产物做模板，可能效果好一些。

我用上次扩增的产物做第二次PCR，又P不出来，所以想找找原因，包括验证这个引物的退火温度等等
谢谢你的回帖
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3楼2012-12-18 12:32:59
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
hwchen2000: 金币+5 2013-01-02 11:10:32
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-12-18 12:27:32
你要扩增的序列（1K）可能太长了，就是很难。你可以用上次扩增出来的产物做模板，可能效果好一些。

软件计算的退火温度是不准确的，你要怀疑是退火温度的原因，就做个退火温度的梯度看看吧。
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4楼2012-12-18 12:56:11
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hwchen2000

金虫 (正式写手)
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引用回帖:
5楼: Originally posted by 牧歌ping at 2012-12-18 17:26:04
RT-PCR即反转录PCR，需要注意的有以下几点：
1、首先看RNA是否完整，一般RNA电泳检测，28S的亮度约是18S的两倍，说明RNA完整，否则会含有其他RNA，比如mRNA，会影响后续逆转；
2、我们做逆转一般用的是Takara的逆 ...

谢谢你的帮助！
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6楼2012-12-21 13:38:56
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czcpudai

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2012-12-22 18:54:18
hwchen2000: 金币+10 2013-01-02 11:09:17
我曾经遇到过与你相同的问题，只是你的目的片段比较大，我觉得最好从以下几个方面考虑：
1.首先一定要保证你的RAN的纯度和完整性都要好，主要是纯度一定要好！这一步是基础。
2.在做RT的时候，可以尝试增大RNA的量，2ug也可以，不过一定要在冰上进行。
3.做PCR这一步的时候，我觉得你最好使用快速高保真酶来扩增，可以用PrimeStar这种酶来扩增，可以先扩增内参看看。这一步我觉得退火温度可能不会是大的问题，主要是酶，体系最好是25ul，不要用50ul的体系。
4.如果一直没有结果的话，没有办法，只有从头再做，保证每一步都是可信的，然后再往下做。
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hwchen2000
7楼2012-12-21 20:34:51
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wangqi20092

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
hwchen2000: 金币+5 2013-01-02 11:10:17
1000bp根本不算大！第一用内参基因扩一下 ，确认模版能用，也确认你的PCR所有试剂能用。第二退火温度用三倍GC+2倍的AT算一下，我感觉退火温度可能太低了。第三，把你出条带那个PCR产物再跑一下，看有没有条带了，如果有，看多亮，太亮的话要稀释的。
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hwchen2000
8楼2012-12-21 21:52:01
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hwchen2000

金虫 (正式写手)
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引用回帖:
7楼: Originally posted by czcpudai at 2012-12-21 20:34:51
我曾经遇到过与你相同的问题，只是你的目的片段比较大，我觉得最好从以下几个方面考虑：
1.首先一定要保证你的RAN的纯度和完整性都要好，主要是纯度一定要好！这一步是基础。
2.在做RT的时候，可以尝试增大RNA的量 ...

谢谢你的帮助！
1.RNA最大的时候曾经用过2ug的量
2.我用的酶是Taq+pfu，因为是特定木本植物，所以找不到内参可以做
3.我的PCR体系一直用的20ul体系
现在最头疼的是温度从48-63℃都能出现弥散的非特异性扩增
没办法，现在还从头来，像你说的做好每一步再说
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9楼2012-12-25 10:06:30
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hwchen2000

金虫 (正式写手)
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引用回帖:
8楼: Originally posted by wangqi20092 at 2012-12-21 21:52:01
1000bp根本不算大！第一用内参基因扩一下 ，确认模版能用，也确认你的PCR所有试剂能用。第二退火温度用三倍GC+2倍的AT算一下，我感觉退火温度可能太低了。第三，把你出条带那个PCR产物再跑一下，看有没有条带了，如 ...

那个1000bp的条带我也不能确定是不是因为DNA的残留引起的，但是那个出条带的PCR产物第二次就跑不出来了
还是谢谢你的帮助！
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10楼2012-12-25 10:08:18
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