应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RT-PCR高手请进
111/2返回列表12下一页
查看: 1828  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

hwchen2000

金虫 (正式写手)

[求助] RT-PCR高手请进

我现在做RT-PCR多次，只有一次做第二链合成电泳后显示有约1000bp的条带，但是再也没有重复出来，所以想请教一下各位高手
RNA模板约1ug
我的PCR引物是
forwards: 5'-ggatatcATGGCAGCCANAGATGCTTGTATTG-3'
rewards:  5'-cccaagcttCTAGAATGCAGCACCAACGAAGGGT-3'
（小写为保护碱基）
请大侠帮我验证这个引物的退火温度，我现在是55℃
求教了！！
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

PCR技术 分子生化实验经验积累

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-12-18 10:30:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

牧歌ping

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 感谢应助！ 2012-12-22 18:53:44
hwchen2000: 金币+5, ★有帮助 2013-01-02 11:08:40
RT-PCR即反转录PCR，需要注意的有以下几点：
1、首先看RNA是否完整，一般RNA电泳检测，28S的亮度约是18S的两倍，说明RNA完整，否则会含有其他RNA，比如mRNA，会影响后续逆转；
2、我们做逆转一般用的是Takara的逆转录试剂盒，逆转效果还不错吧。先看你逆转时RNA加的量是否合适，过小或过高都影响逆转效果，再看你逆转的过程是不是有差错；
3、逆转为cDNA后，先用其他常用基因检测下cDNA的质量，比如先扩增actin，一般这个退火温度是确定的，如果结果好再扩增你的目的基因，至少说明模板没问题；
4、能扩出actin基因而扩不出你的目的基因，可以做退火温度梯度，一般我们用这个引物设计软件http://www.sigma-genosys.com/calc/DNAcalc.asp 测出的退火温度-5度都能PCR出结果，除非上下游引物退火温度差距太大
希望对你能有帮助！
赞一下(3人) 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

hwchen2000
5楼2012-12-18 17:26:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
hwchen2000: 金币+5 2013-01-02 11:10:46
你要扩增的序列（1K）可能太长了，就是很难。你可以用上次扩增出来的产物做模板，可能效果好一些。
赞一下 回复此楼
2楼2012-12-18 12:27:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hwchen2000

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-12-18 12:27:32
你要扩增的序列（1K）可能太长了，就是很难。你可以用上次扩增出来的产物做模板，可能效果好一些。

我用上次扩增的产物做第二次PCR，又P不出来，所以想找找原因，包括验证这个引物的退火温度等等
谢谢你的回帖
赞一下 回复此楼
3楼2012-12-18 12:32:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
hwchen2000: 金币+5 2013-01-02 11:10:32
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-12-18 12:27:32
你要扩增的序列（1K）可能太长了，就是很难。你可以用上次扩增出来的产物做模板，可能效果好一些。

软件计算的退火温度是不准确的，你要怀疑是退火温度的原因，就做个退火温度的梯度看看吧。
赞一下 回复此楼
4楼2012-12-18 12:56:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hwchen2000

金虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by 牧歌ping at 2012-12-18 17:26:04
RT-PCR即反转录PCR，需要注意的有以下几点：
1、首先看RNA是否完整，一般RNA电泳检测，28S的亮度约是18S的两倍，说明RNA完整，否则会含有其他RNA，比如mRNA，会影响后续逆转；
2、我们做逆转一般用的是Takara的逆 ...

谢谢你的帮助！
回复此楼
6楼2012-12-21 13:38:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

czcpudai

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2012-12-22 18:54:18
hwchen2000: 金币+10 2013-01-02 11:09:17
我曾经遇到过与你相同的问题，只是你的目的片段比较大，我觉得最好从以下几个方面考虑：
1.首先一定要保证你的RAN的纯度和完整性都要好，主要是纯度一定要好！这一步是基础。
2.在做RT的时候，可以尝试增大RNA的量，2ug也可以，不过一定要在冰上进行。
3.做PCR这一步的时候，我觉得你最好使用快速高保真酶来扩增，可以用PrimeStar这种酶来扩增，可以先扩增内参看看。这一步我觉得退火温度可能不会是大的问题，主要是酶，体系最好是25ul，不要用50ul的体系。
4.如果一直没有结果的话，没有办法，只有从头再做，保证每一步都是可信的，然后再往下做。
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

hwchen2000
7楼2012-12-21 20:34:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wangqi20092

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
hwchen2000: 金币+5 2013-01-02 11:10:17
1000bp根本不算大！第一用内参基因扩一下 ，确认模版能用，也确认你的PCR所有试剂能用。第二退火温度用三倍GC+2倍的AT算一下，我感觉退火温度可能太低了。第三，把你出条带那个PCR产物再跑一下，看有没有条带了，如果有，看多亮，太亮的话要稀释的。
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

hwchen2000
8楼2012-12-21 21:52:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hwchen2000

金虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
7楼: Originally posted by czcpudai at 2012-12-21 20:34:51
我曾经遇到过与你相同的问题，只是你的目的片段比较大，我觉得最好从以下几个方面考虑：
1.首先一定要保证你的RAN的纯度和完整性都要好，主要是纯度一定要好！这一步是基础。
2.在做RT的时候，可以尝试增大RNA的量 ...

谢谢你的帮助！
1.RNA最大的时候曾经用过2ug的量
2.我用的酶是Taq+pfu，因为是特定木本植物，所以找不到内参可以做
3.我的PCR体系一直用的20ul体系
现在最头疼的是温度从48-63℃都能出现弥散的非特异性扩增
没办法，现在还从头来，像你说的做好每一步再说
赞一下 回复此楼
9楼2012-12-25 10:06:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hwchen2000

金虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by wangqi20092 at 2012-12-21 21:52:01
1000bp根本不算大！第一用内参基因扩一下 ，确认模版能用，也确认你的PCR所有试剂能用。第二退火温度用三倍GC+2倍的AT算一下，我感觉退火温度可能太低了。第三，把你出条带那个PCR产物再跑一下，看有没有条带了，如 ...

那个1000bp的条带我也不能确定是不是因为DNA的残留引起的，但是那个出条带的PCR产物第二次就跑不出来了
还是谢谢你的帮助！
赞一下 回复此楼
10楼2012-12-25 10:08:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 hwchen2000 的主题更新
111/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 u1xkze8ybe 2026-07-30 7/350 2026-07-31 12:10 by syhhffkrym
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 u1xkze8ybe 2026-07-30 3/150 2026-07-31 12:08 by syhhffkrym
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 u1xkze8ybe 2026-07-30 6/300 2026-07-31 12:05 by syhhffkrym
[教师之家] 基础研究怎么拉横向，学校到款任务越来越多，难以完成 拉横向，都有哪些途径啊 +6 锦衣卫寒战 2026-07-28 6/300 2026-07-31 11:27 by syl200707
[高分子] HXDI做水性聚氨酯乳液，是不是特别容易出渣 15+3 yuyusuv 2026-07-29 3/150 2026-07-31 09:21 by huizingga
[基金申请] 小木虫看见有人已经知道结果了 +15 1234567wang 2026-07-25 19/950 2026-07-31 08:30 by ZJTJZ
[基金申请] 2026年国自然面上资助率 +8 布布和一二 2026-07-30 8/400 2026-07-31 01:51 by alongwaytogo
[基金申请] 系统今天又提示维护了，估计离放榜不远了 +11 winnerche 2026-07-29 15/750 2026-07-30 23:08 by jnhyjjm
[基金申请] 微信指数没变化，科研之友没阅读 +14 wangze12014 2026-07-28 17/850 2026-07-30 20:10 by kissu88
[考博] 申请2027年材料/化学类博士 10+3 考研老狗? 2026-07-25 5/250 2026-07-30 19:33 by 白色木鱼
[基金申请] 你们的时间戳变了吗 +3 archvillain 2026-07-30 4/200 2026-07-30 18:53 by levinzhwen
[基金申请] 今年的WR进展到哪一步了？ +5 wsgjhwz 2026-07-25 9/450 2026-07-30 12:59 by 可淡不可忘
[有机交流] 产物和副产物价值比较 30+4 小汤02 2026-07-27 5/250 2026-07-30 12:44 by czyzsu
[基金申请] 时间戳他又来了 +14 晓晓爱翠翠 2026-07-26 17/850 2026-07-29 16:30 by 呵呵二哥
[有机交流] 这个自发加氧反应的机理是什么？ 50+4 YUAN2273 2026-07-25 7/350 2026-07-29 12:27 by xiaobenpu
[基金申请] 没消息就是被刷了呗 +13 lambert2014 2026-07-24 14/700 2026-07-29 10:38 by msh145800
[基金申请] 这种情况还有戏吗 +5 drbart 2026-07-27 11/550 2026-07-29 05:50 by drbart
[基金申请] 同事接到电话了，我却没有 +4 1234567wang 2026-07-27 4/200 2026-07-28 10:11 by GOODLUCKER
[基金申请] 准备明年的基金了 +5 Tide man 2026-07-27 5/250 2026-07-28 09:25 by newfuzzy1
[分析] 水蒸气蒸馏法乳化现象 +3 月光娇娇 2026-07-26 3/150 2026-07-26 23:25 by caiyun
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭