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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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hwchen2000

金虫 (正式写手)

[求助] RT-PCR高手请进

我现在做RT-PCR多次,只有一次做第二链合成电泳后显示有约1000bp的条带,但是再也没有重复出来,所以想请教一下各位高手
RNA模板约1ug
我的PCR引物是
forwards: 5'-ggatatcATGGCAGCCANAGATGCTTGTATTG-3'
rewards:  5'-cccaagcttCTAGAATGCAGCACCAACGAAGGGT-3'
(小写为保护碱基)
请大侠帮我验证这个引物的退火温度,我现在是55℃
求教了!!
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hwchen2000

金虫 (正式写手)

送鲜花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by wangqi20092 at 2012-12-21 21:52:01
1000bp根本不算大!第一用内参基因扩一下 ,确认模版能用,也确认你的PCR所有试剂能用。第二退火温度用三倍GC+2倍的AT算一下,我感觉退火温度可能太低了。第三,把你出条带那个PCR产物再跑一下,看有没有条带了,如 ...

那个1000bp的条带我也不能确定是不是因为DNA的残留引起的,但是那个出条带的PCR产物第二次就跑不出来了
还是谢谢你的帮助!
10楼2012-12-25 10:08:18
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查看全部 11 个回答

zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
hwchen2000: 金币+5 2013-01-02 11:10:46
你要扩增的序列(1K)可能太长了,就是很难。你可以用上次扩增出来的产物做模板,可能效果好一些。
2楼2012-12-18 12:27:32
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hwchen2000

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-12-18 12:27:32
你要扩增的序列(1K)可能太长了,就是很难。你可以用上次扩增出来的产物做模板,可能效果好一些。

我用上次扩增的产物做第二次PCR,又P不出来,所以想找找原因,包括验证这个引物的退火温度等等
谢谢你的回帖
3楼2012-12-18 12:32:59
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
hwchen2000: 金币+5 2013-01-02 11:10:32
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-12-18 12:27:32
你要扩增的序列(1K)可能太长了,就是很难。你可以用上次扩增出来的产物做模板,可能效果好一些。

软件计算的退火温度是不准确的,你要怀疑是退火温度的原因,就做个退火温度的梯度看看吧。
4楼2012-12-18 12:56:11
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