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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RT-PCR高手请进
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hwchen2000

金虫 (正式写手)

[求助] RT-PCR高手请进

我现在做RT-PCR多次，只有一次做第二链合成电泳后显示有约1000bp的条带，但是再也没有重复出来，所以想请教一下各位高手
RNA模板约1ug
我的PCR引物是
forwards: 5'-ggatatcATGGCAGCCANAGATGCTTGTATTG-3'
rewards:  5'-cccaagcttCTAGAATGCAGCACCAACGAAGGGT-3'
（小写为保护碱基）
请大侠帮我验证这个引物的退火温度，我现在是55℃
求教了！！
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1楼 2012-12-18 10:30:05
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by hwchen2000 at 2012-12-25 10:06:30
谢谢你的帮助！
1.RNA最大的时候曾经用过2ug的量
2.我用的酶是Taq+pfu，因为是特定木本植物，所以找不到内参可以做
3.我的PCR体系一直用的20ul体系
现在最头疼的是温度从48-63℃都能出现弥散的非特异性扩增
没 ...

是的，因为做RT-PCR的步骤比较多，很难找到原因，但是重要的无非是RNA的完整性和纯度；RT体系尤其是逆转录酶；PCR扩增体系，如果引物可以的话，我觉得问题最大的就是酶的问题，退火温度太低虽然能引起非特异性，但是只要有目的条带也是可以的啊。我用的RNA提取试剂是TaKaRa的，RT试剂盒是Bio-rda的。觉得用的还可以。
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11楼2012-12-25 12:11:43
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
hwchen2000: 金币+5 2013-01-02 11:10:46
你要扩增的序列（1K）可能太长了，就是很难。你可以用上次扩增出来的产物做模板，可能效果好一些。
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2楼2012-12-18 12:27:32
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hwchen2000

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-12-18 12:27:32
你要扩增的序列（1K）可能太长了，就是很难。你可以用上次扩增出来的产物做模板，可能效果好一些。

我用上次扩增的产物做第二次PCR，又P不出来，所以想找找原因，包括验证这个引物的退火温度等等
谢谢你的回帖
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3楼2012-12-18 12:32:59
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
hwchen2000: 金币+5 2013-01-02 11:10:32
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-12-18 12:27:32
你要扩增的序列（1K）可能太长了，就是很难。你可以用上次扩增出来的产物做模板，可能效果好一些。

软件计算的退火温度是不准确的，你要怀疑是退火温度的原因，就做个退火温度的梯度看看吧。
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4楼2012-12-18 12:56:11
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