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hwchen2000

金虫 (正式写手)

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[求助] RT-PCR高手请进

我现在做RT-PCR多次，只有一次做第二链合成电泳后显示有约1000bp的条带，但是再也没有重复出来，所以想请教一下各位高手
RNA模板约1ug
我的PCR引物是
forwards: 5'-ggatatcATGGCAGCCANAGATGCTTGTATTG-3'
rewards: 5'-cccaagcttCTAGAATGCAGCACCAACGAAGGGT-3'
（小写为保护碱基）
请大侠帮我验证这个引物的退火温度，我现在是55℃
求教了！！

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1楼 2012-12-18 10:30:05

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

czcpudai

铜虫 (正式写手)

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专业: 微生物生理与生物化学

引用回帖:

9楼: Originally posted by hwchen2000 at 2012-12-25 10:06:30
谢谢你的帮助！
1.RNA最大的时候曾经用过2ug的量
2.我用的酶是Taq+pfu，因为是特定木本植物，所以找不到内参可以做
3.我的PCR体系一直用的20ul体系
现在最头疼的是温度从48-63℃都能出现弥散的非特异性扩增
没 ...

是的，因为做RT-PCR的步骤比较多，很难找到原因，但是重要的无非是RNA的完整性和纯度；RT体系尤其是逆转录酶；PCR扩增体系，如果引物可以的话，我觉得问题最大的就是酶的问题，退火温度太低虽然能引起非特异性，但是只要有目的条带也是可以的啊。我用的RNA提取试剂是TaKaRa的，RT试剂盒是Bio-rda的。觉得用的还可以。