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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 设计荧光定量PCR引物
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忘记将来

木虫 (正式写手)

[求助] 设计荧光定量PCR引物 已有2人参与

问几个关于荧光定量设计引物的问题，
1：设计引物用的序列是不是只能是cDNA？
2：开始分析待测序列时，是不是先blast这个序列 然后下载比对找保守区的序列 设计引物啊？  
3：设计好的引物，分析其特异性时，是不是拿设计的引物去blast，如果blast的结果没有待测的物种就是可以用的。       我是这么理解的 也不知道对不对

使用的软件是  Beacon Designer，哪位高手可以把这个详细步骤传授一下，初学者 问的问题有点弱。
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1楼 2014-07-15 13:22:35
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Neo2000

木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
忘记将来(kx444555代发): 金币+1, 鼓励交流 2014-07-16 08:37:23
没你想的那么复杂，primer-blast可以解决问题

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2楼2014-07-15 19:09:04
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xmcliulei

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-07-18 15:35:30
gyesang: 应助指数+1 2014-07-18 15:35:56
忘记将来: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-07-21 14:03:52
直接把待测序列放在NCBI的primer blast里面，设定产物大小150-250bp，引物上下游横跨至少一个内含子再把最下面错配分子大小改成10000（我一般改成这个）点primer blast即可。里面会有好几对引物供你选择，选择错配产物少的，最好是没有的几对引物合成即可。做Realtime之前先用这几对引物扩增下你的模板，跑个胶看看，没杂带和二聚体就能用了~
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3楼2014-07-18 13:52:52
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未婚

金虫 (正式写手)

分子小生

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-20 21:30:44
忘记将来: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-07-21 14:04:14
引物设计用cDNA序列，把CDS区拼接起来，然后在NCBI的Primer-Blase里面设计，设计引物片段在100-200bp左右就可以了，最好在CDS区中间设计。然后用一般的PCR来摸索条件，最后PCR产物测序，测序结果和你的CDS区目标片段的序列对比，对比不错的话就可以直接在定量PCR仪上跑了。
我现在正在做测序这一步，希望多多交流！谢谢
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You can't depend on luck, so you had better focus on the others!
4楼2014-07-18 16:43:27
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未婚

金虫 (正式写手)

分子小生

【答案】应助回帖

朋友   现在做得怎么样了？
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5楼2014-07-20 20:33:25
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忘记将来

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 未婚 at 2014-07-20 20:33:25
朋友   现在做得怎么样了？

正在摸索
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6楼2014-07-21 14:04:30
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忘记将来

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 未婚 at 2014-07-18 16:43:27
引物设计用cDNA序列，把CDS区拼接起来，然后在NCBI的Primer-Blase里面设计，设计引物片段在100-200bp左右就可以了，最好在CDS区中间设计。然后用一般的PCR来摸索条件，最后PCR产物测序，测序结果和你的CDS区目标片段 ...

你这种做法，也是想跨内含子，好像没有人这么做哦
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7楼2014-07-21 14:06:15
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

如果要检测mRNA的量就用cDNA，如果检测基因组中的序列就不用cDNA序列。
确定了目的序列后设计引物，blast检测一下有没有和其它基因重合，物种倒是次要的，除非你的样品是多物种混合的。
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8楼2014-07-21 17:18:15
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未婚

金虫 (正式写手)

分子小生
引用回帖:
7楼: Originally posted by 忘记将来 at 2014-07-21 14:06:15
你这种做法，也是想跨内含子，好像没有人这么做哦...

是的  是想跨内含子，那一般是怎么做呢？！？？！？！？！？！？
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You can't depend on luck, so you had better focus on the others!
9楼2014-07-21 18:12:33
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