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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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摩羯的心

铁虫 (小有名气)

[求助] 荧光定量PCR阴性对照P出了目的条带 已有3人参与

各位虫友,我做绝对定量,以质粒为模板,设置了阴性对照,CT值与样品的很接近,跑电泳结果竟然有目的条带,这是怎么回事啊?因为我引物的特殊性是要区分基因突变型,因此引物中引入了错配碱基,所以做PCR的酶必须不具有3'-5'外切酶活性,现在用的是伯乐的盒子,适合iQ5机型,大家给推荐比较好用的做荧光定量的试剂盒吧?还有有没有人用普通PCR试剂,只是里面加入荧光染料,做荧光定量的,这样可行吗?大家帮帮忙吧  实验遇见瓶颈了
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yb19841014

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
摩羯的心(kx444555代发): 金币+2, 鼓励交流 2014-04-29 08:40:14
把试剂,引物,模板重新换新的吧  估计是被污染了啊  我们实验室现在用的是vazyme的 Qmix  还不错
2楼2014-04-27 21:56:29
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摩羯的心

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by yb19841014 at 2014-04-27 21:56:29
把试剂,引物,模板重新换新的吧  估计是被污染了啊  我们实验室现在用的是vazyme的 Qmix  还不错

我把引物 模板都换成新的了 还是如此啊  而且试剂 也是刚开始用的
3楼2014-04-28 08:22:41
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-04-29 08:40:18
按照这种情况的话,很有可能是气溶胶污染了,也就是环境污染了,换个实验环境试试。荧光定量法进行基因突变检测时,染料法需要采用饱和染料,比如EvaGreen,探针法就无需加入荧光染料了
rainwater
4楼2014-04-28 11:54:17
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摩羯的心

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-04-28 11:54:17
按照这种情况的话,很有可能是气溶胶污染了,也就是环境污染了,换个实验环境试试。荧光定量法进行基因突变检测时,染料法需要采用饱和染料,比如EvaGreen,探针法就无需加入荧光染料了

实验室里为什么就会有气溶胶污染了呢 而且 我换了个环境做的结果是一样的呢  阴性对照还是跟样品的ct值很接近  染料必须用EvaGreen 吗 我用的是sybr Green 伯乐的试剂盒
5楼2014-04-28 15:44:29
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好好后生

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 摩羯的心 at 2014-04-28 15:44:29
实验室里为什么就会有气溶胶污染了呢 而且 我换了个环境做的结果是一样的呢  阴性对照还是跟样品的ct值很接近  染料必须用EvaGreen 吗 我用的是sybr Green 伯乐的试剂盒...

定量的片段都很小,跑完之后,如果打开了管子,就很可能产生气溶胶
6楼2014-04-29 09:39:11
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 摩羯的心 at 2014-04-28 15:44:29
实验室里为什么就会有气溶胶污染了呢 而且 我换了个环境做的结果是一样的呢  阴性对照还是跟样品的ct值很接近  染料必须用EvaGreen 吗 我用的是sybr Green 伯乐的试剂盒...

检测基因突变,你如果采用染料法的话最好使用饱和染料,染料法检测基因突变的依据是根据Tm值的差异来区分野生型和突变型的,SYBR Green I是非饱和染料,分辨率低,很难区分开来,检测灵敏度低。EvaGreen是饱和染料,分辨率高,检测灵敏度高。
rainwater
7楼2014-04-29 16:18:24
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

另外,气溶胶的污染的问题在qPCR是很常见的问题,你可以查下资料,有关这个问题有一些解决方法
rainwater
8楼2014-04-29 16:20:51
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yb19841014

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 摩羯的心 at 2014-04-28 08:22:41
我把引物 模板都换成新的了 还是如此啊  而且试剂 也是刚开始用的...

那只能过一段时间在做了  肯定是有污染啦
9楼2014-05-02 10:01:22
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

用什么做的阴性对照?
10楼2014-05-05 10:10:28
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