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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 荧光定量PCR阴性对照P出了目的条带
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摩羯的心

铁虫 (小有名气)

[求助] 荧光定量PCR阴性对照P出了目的条带 已有3人参与

各位虫友，我做绝对定量，以质粒为模板，设置了阴性对照，CT值与样品的很接近，跑电泳结果竟然有目的条带，这是怎么回事啊？因为我引物的特殊性是要区分基因突变型，因此引物中引入了错配碱基，所以做PCR的酶必须不具有3'-5'外切酶活性，现在用的是伯乐的盒子，适合iQ5机型，大家给推荐比较好用的做荧光定量的试剂盒吧？还有有没有人用普通PCR试剂，只是里面加入荧光染料，做荧光定量的，这样可行吗？大家帮帮忙吧  实验遇见瓶颈了
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1楼 2014-04-26 10:22:27
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yb19841014

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
摩羯的心(kx444555代发): 金币+2, 鼓励交流 2014-04-29 08:40:14
把试剂，引物，模板重新换新的吧  估计是被污染了啊  我们实验室现在用的是vazyme的 Qmix  还不错
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2楼2014-04-27 21:56:29
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摩羯的心

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yb19841014 at 2014-04-27 21:56:29
把试剂，引物，模板重新换新的吧  估计是被污染了啊  我们实验室现在用的是vazyme的 Qmix  还不错

我把引物 模板都换成新的了 还是如此啊  而且试剂 也是刚开始用的
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3楼2014-04-28 08:22:41
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-04-29 08:40:18
按照这种情况的话，很有可能是气溶胶污染了，也就是环境污染了，换个实验环境试试。荧光定量法进行基因突变检测时，染料法需要采用饱和染料，比如EvaGreen，探针法就无需加入荧光染料了
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rainwater
4楼2014-04-28 11:54:17
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摩羯的心

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-04-28 11:54:17
按照这种情况的话，很有可能是气溶胶污染了，也就是环境污染了，换个实验环境试试。荧光定量法进行基因突变检测时，染料法需要采用饱和染料，比如EvaGreen，探针法就无需加入荧光染料了

实验室里为什么就会有气溶胶污染了呢 而且 我换了个环境做的结果是一样的呢  阴性对照还是跟样品的ct值很接近  染料必须用EvaGreen 吗 我用的是sybr Green 伯乐的试剂盒
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5楼2014-04-28 15:44:29
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好好后生

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 摩羯的心 at 2014-04-28 15:44:29
实验室里为什么就会有气溶胶污染了呢 而且 我换了个环境做的结果是一样的呢  阴性对照还是跟样品的ct值很接近  染料必须用EvaGreen 吗 我用的是sybr Green 伯乐的试剂盒...

定量的片段都很小，跑完之后，如果打开了管子，就很可能产生气溶胶
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6楼2014-04-29 09:39:11
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 摩羯的心 at 2014-04-28 15:44:29
实验室里为什么就会有气溶胶污染了呢 而且 我换了个环境做的结果是一样的呢  阴性对照还是跟样品的ct值很接近  染料必须用EvaGreen 吗 我用的是sybr Green 伯乐的试剂盒...

检测基因突变，你如果采用染料法的话最好使用饱和染料，染料法检测基因突变的依据是根据Tm值的差异来区分野生型和突变型的，SYBR Green I是非饱和染料，分辨率低，很难区分开来，检测灵敏度低。EvaGreen是饱和染料，分辨率高，检测灵敏度高。
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rainwater
7楼2014-04-29 16:18:24
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

另外，气溶胶的污染的问题在qPCR是很常见的问题，你可以查下资料，有关这个问题有一些解决方法
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rainwater
8楼2014-04-29 16:20:51
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yb19841014

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 摩羯的心 at 2014-04-28 08:22:41
我把引物 模板都换成新的了 还是如此啊  而且试剂 也是刚开始用的...

那只能过一段时间在做了  肯定是有污染啦
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9楼2014-05-02 10:01:22
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
用什么做的阴性对照？
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10楼2014-05-05 10:10:28
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