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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求高手帮忙解答荧光定量PCR融解曲线、标准曲线和样品浓度问题
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jxmingcyl

铁虫 (初入文坛)

[求助] 求高手帮忙解答荧光定量PCR融解曲线、标准曲线和样品浓度问题

最近一直在做定量PCR，跑了很多次，总是出现问题，求高手帮忙解决
求高手帮忙解答荧光定量PCR融解曲线、标准曲线和样品浓度问题
表样和DNA样品26.jpg


求高手帮忙解答荧光定量PCR融解曲线、标准曲线和样品浓度问题-1
标样溶解曲线.png


求高手帮忙解答荧光定量PCR融解曲线、标准曲线和样品浓度问题-2
标样和样品扩增曲线.png


求高手帮忙解答荧光定量PCR融解曲线、标准曲线和样品浓度问题-3
标准曲线.png
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1楼 2013-11-28 10:25:15
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distant616

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-11-28 12:45:49
标准曲线做的还是挺好的，不过样品怎么好像是没有目的片段的扩增呢？引物，换一下引物可以考虑一下？
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2楼2013-11-28 11:56:01
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niil

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
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kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2013-11-28 12:45:58
从熔解曲线上看，引物质量挺好，稍微有一点二聚体，可以降低一点引物的使用量。
标准曲线做的很不好。你使用的标准样品浓度太高，Ct值都小于10。你的阈值设的有点高，阈值最好设置在产物刚刚快速增加的区间，要符合实时定量的数学模型.
做好一个标准曲线，标准样品的浓度需要好好的去做梯度稀释。使得各梯度的样品Ct值在15-28的区间比较好，你的标准样品太集中了，没有代表性。
最后获得的标准曲线的slope应该在-3.32左右，扩增效率才能达到100%。
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Stop fighting,let it flow.
3楼2013-11-28 12:25:55
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zzl2516

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-28 17:01:26
你这标线线性虽然很好但是扩增效率和斜率都不满足要求啊，而且你样品根本没在标线范围内啊。。这标线是在定什么。。。把标线稀释到样品的范围内吧。。在从新调引物和模板浓度应该就行了
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4楼2013-11-28 15:15:30
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jhhj2011

新虫 (初入文坛)
请问你这个是绝对定量吗 ？你的引物和DNA分别加的是多少啊，我最近也在做这个但是标准曲线一直做不好
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5楼2015-06-03 14:30:06
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