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jxmingcyl

铁虫 (初入文坛)

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[求助] 求高手帮忙解答荧光定量PCR融解曲线、标准曲线和样品浓度问题

最近一直在做定量PCR，跑了很多次，总是出现问题，求高手帮忙解决

表样和DNA样品26.jpg

标样溶解曲线.png

标样和样品扩增曲线.png

标准曲线.png

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1楼 2013-11-28 10:25:15

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niil

金虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2013-11-28 12:45:58

从熔解曲线上看，引物质量挺好，稍微有一点二聚体，可以降低一点引物的使用量。
标准曲线做的很不好。你使用的标准样品浓度太高，Ct值都小于10。你的阈值设的有点高，阈值最好设置在产物刚刚快速增加的区间，要符合实时定量的数学模型.
做好一个标准曲线，标准样品的浓度需要好好的去做梯度稀释。使得各梯度的样品Ct值在15-28的区间比较好，你的标准样品太集中了，没有代表性。
最后获得的标准曲线的slope应该在-3.32左右，扩增效率才能达到100%。