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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 荧光定量扩增效率问题
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thinkerboy

铁虫 (小有名气)

[求助] 荧光定量扩增效率问题

最近在做相对荧光定量的标准曲线，机器是ABI stepone但是其中有个基因的扩增效率达到121了并且有一个点的两个重复之间ct值超过了0.2.
请高手帮我看看扩增效率怎么这么高，我如果提高退火温度扩增效率会不会小点。
荧光定量扩增效率问题
捕获1.PNG


荧光定量扩增效率问题-1
捕获2.PNG


荧光定量扩增效率问题-2
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1楼 2013-06-13 11:14:49
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love_st

金虫 (著名写手)
★
myprayer: 金币+1, Send one rose fragrance in hand, thank you loosen one's purse strings generously, look forward to your wonderful 2013-06-13 13:41:14
我感觉两个方面，阈值太高，还有就是似乎梯度稀释的不是太好
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2楼2013-06-13 11:54:04
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thinkerboy

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by love_st at 2013-06-13 11:54:04
我感觉两个方面，阈值太高，还有就是似乎梯度稀释的不是太好

阈值是系统自己设定的，梯度稀释我只稀释了4个梯度。
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3楼2013-06-13 14:37:31
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love_st

金虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by thinkerboy at 2013-06-13 14:37:31
阈值是系统自己设定的，梯度稀释我只稀释了4个梯度。...

能否手动设定，你梯度如果是10倍稀释的话，感觉不是很好
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4楼2013-06-13 14:52:41
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-06-13 19:23:21
thinkerboy: 金币+2 2013-06-17 15:09:42
你这个单从扩增效率来看是稍微不太理想 slope 是-2.8 左右 不是很好 另外你这个溶解曲线重合的也不是很好 表明引物设计的特异性不是很高
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5楼2013-06-13 16:41:03
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独孤蚕

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

我感觉主要还是浓度梯度没有做好。稀释不好，对扩增效率的计算影响很大的。
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6楼2013-07-04 08:30:45
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taccycle

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by love_st at 2013-06-13 11:54:04
我感觉两个方面，阈值太高，还有就是似乎梯度稀释的不是太好

阈值有可能设置的不好，你可以看一下那个半对数的图，然后手动调节阈值线到指数扩增区域，梯度稀释的话问题可能不大，但是有一点，你最好多设置几个浓度梯度，4个太少了，至少要有5个，你的熔解曲线问题倒是不大，重合的也还可以
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用心
7楼2013-10-17 12:37:20
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