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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 实时荧光定量 相对定量 标准曲线的问题
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桃之夭夭pFly

新虫 (初入文坛)

[求助] 实时荧光定量 相对定量 标准曲线的问题

各位同仁：
    我最近做相对定量，首先做标准曲线看内参和目的基因的扩增效率是否一致，在这个环节上一直无法突破。
    问题是：我的cDNA以10倍梯度稀释了13个梯度，但是Ct值都很接近，都在19-21之间。我的体系是takela的，20ul
mix10
上0.4
下0.4
模板1
水8.2

95° 30s
95°5s
60°30s   40个循环

用的是96孔板，先把mix和上下，水混匀分装后，再加模板。
mix用之前先颠倒混匀。
加样时避免气泡的产生。

我的cDNA是由天根的反转录试剂盒得来的，用5ug的总RNA反转录成50ul的体系。

请各位帮我分析一下原因吧！做了3周了，一直这样无进展，很苦闷！谢谢您的分享和帮助了~
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1楼 2013-03-21 00:30:10
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桃之夭夭pFly

新虫 (初入文坛)
求助啊求助！
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2楼2013-03-21 12:53:17
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phhcrab

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
桃之夭夭pFly: 金币+10 2013-03-21 17:31:58
你是10倍稀释的么？怎么会稀释了13个梯度，Ct都差不多呢？没稀释好吧，或者有污染。
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3楼2013-03-21 13:37:10
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bunnyxia

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-04-27 14:45:25
起始的ct值不高，可以用PCR产物试试。稀释梯度一般6、7个就行，可以5倍或10倍稀释。稀释时最好10ul稀释到100ul，而且要混匀，不要相互污染。
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4楼2013-03-21 17:09:12
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桃之夭夭pFly

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by phhcrab at 2013-03-21 13:37:10
你是10倍稀释的么？怎么会稀释了13个梯度，Ct都差不多呢？没稀释好吧，或者有污染。

我是吸1ul加9ul的水，吸打混匀后再吸1ul到另一个pcr管中，加9ul水，如此重复做的~‘
是不是扩大成10ul加90ul的水这样稀释比较好？
你说的污染指的是哪一步怎么污染的呢？
谢谢你的回复~
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5楼2013-03-21 17:29:48
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桃之夭夭pFly

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by bunnyxia at 2013-03-21 17:09:12
起始的ct值不高，可以用PCR产物试试。稀释梯度一般6、7个就行，可以5倍或10倍稀释。稀释时最好10ul稀释到100ul，而且要混匀，不要相互污染。

pcr产物？意思是用普通pcr扩增我的目的基因后，再作为模板稀释？
那我标准曲线这样得出，我做相对定量的时候也要这样吗》？
谢谢你的回复~
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6楼2013-03-21 17:31:41
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我反正-信了

木虫 (小有名气)
我也一直在做这个，我用的也是TAKARA的，稀释的梯度没这么多，我是6个，外加三个重复和一个空白，也是10倍稀释，但是按10——100ul来稀释的反应条件中我40Cycies中有三步：95 5s，58  31s，72  30s：其他都差不多，试剂也一样！
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7楼2013-03-22 09:31:34
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zhangqian082

新虫 (小有名气)
你提的RNA有没有去基因组污染呢
而且你做的时候改用八连管试一下，加样顺序：水>sybr green>引物>模板
试一下吧
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8楼2013-03-22 12:08:22
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phhcrab

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 桃之夭夭pFly at 2013-03-21 17:29:48
我是吸1ul加9ul的水，吸打混匀后再吸1ul到另一个pcr管中，加9ul水，如此重复做的~‘
是不是扩大成10ul加90ul的水这样稀释比较好？
你说的污染指的是哪一步怎么污染的呢？
谢谢你的回复~...

确实10ul加到90ul里会好很多的，混匀可以在涡旋振荡器上晃一下，然后离心。反复吹打会增加挂壁的，更何况才10ul。

未必是污染造成的，但是污染在哪一步都可能发生的。比如实验环境、移液器、枪头等等都可能存在污染的，如果你的样品体系很小的话，一点污染造成的影响可能就很大了。

做定量最好是用带滤芯的枪头，如果没这条件的话，那操作要更小心点。
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9楼2013-03-26 11:36:40
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桃之夭夭pFly

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by phhcrab at 2013-03-26 11:36:40
确实10ul加到90ul里会好很多的，混匀可以在涡旋振荡器上晃一下，然后离心。反复吹打会增加挂壁的，更何况才10ul。

未必是污染造成的，但是污染在哪一步都可能发生的。比如实验环境、移液器、枪头等等都可能存在 ...

好的~谢谢了！近期发现是引物的退火温度的问题，提高到65°就好很多了~
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10楼2013-03-27 10:00:32
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