应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 实时荧光定量 相对定量 标准曲线的问题
111/2返回列表12下一页
查看: 3530  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

桃之夭夭pFly

新虫 (初入文坛)

[求助] 实时荧光定量 相对定量 标准曲线的问题

各位同仁：
    我最近做相对定量，首先做标准曲线看内参和目的基因的扩增效率是否一致，在这个环节上一直无法突破。
    问题是：我的cDNA以10倍梯度稀释了13个梯度，但是Ct值都很接近，都在19-21之间。我的体系是takela的，20ul
mix10
上0.4
下0.4
模板1
水8.2

95° 30s
95°5s
60°30s   40个循环

用的是96孔板，先把mix和上下，水混匀分装后，再加模板。
mix用之前先颠倒混匀。
加样时避免气泡的产生。

我的cDNA是由天根的反转录试剂盒得来的，用5ug的总RNA反转录成50ul的体系。

请各位帮我分析一下原因吧！做了3周了，一直这样无进展，很苦闷！谢谢您的分享和帮助了~
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-03-21 00:30:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

桃之夭夭pFly

新虫 (初入文坛)
求助啊求助！
回复此楼
2楼2013-03-21 12:53:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

phhcrab

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
桃之夭夭pFly: 金币+10 2013-03-21 17:31:58
你是10倍稀释的么？怎么会稀释了13个梯度，Ct都差不多呢？没稀释好吧，或者有污染。
赞一下 回复此楼
3楼2013-03-21 13:37:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bunnyxia

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-04-27 14:45:25
起始的ct值不高，可以用PCR产物试试。稀释梯度一般6、7个就行，可以5倍或10倍稀释。稀释时最好10ul稀释到100ul，而且要混匀，不要相互污染。
赞一下 回复此楼
4楼2013-03-21 17:09:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

桃之夭夭pFly

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by phhcrab at 2013-03-21 13:37:10
你是10倍稀释的么？怎么会稀释了13个梯度，Ct都差不多呢？没稀释好吧，或者有污染。

我是吸1ul加9ul的水，吸打混匀后再吸1ul到另一个pcr管中，加9ul水，如此重复做的~‘
是不是扩大成10ul加90ul的水这样稀释比较好？
你说的污染指的是哪一步怎么污染的呢？
谢谢你的回复~
赞一下 回复此楼
5楼2013-03-21 17:29:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

桃之夭夭pFly

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by bunnyxia at 2013-03-21 17:09:12
起始的ct值不高，可以用PCR产物试试。稀释梯度一般6、7个就行，可以5倍或10倍稀释。稀释时最好10ul稀释到100ul，而且要混匀，不要相互污染。

pcr产物？意思是用普通pcr扩增我的目的基因后，再作为模板稀释？
那我标准曲线这样得出，我做相对定量的时候也要这样吗》？
谢谢你的回复~
赞一下 回复此楼
6楼2013-03-21 17:31:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

我反正-信了

木虫 (小有名气)
我也一直在做这个，我用的也是TAKARA的，稀释的梯度没这么多，我是6个，外加三个重复和一个空白，也是10倍稀释，但是按10——100ul来稀释的反应条件中我40Cycies中有三步：95 5s，58  31s，72  30s：其他都差不多，试剂也一样！
赞一下 回复此楼
7楼2013-03-22 09:31:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhangqian082

新虫 (小有名气)
你提的RNA有没有去基因组污染呢
而且你做的时候改用八连管试一下，加样顺序：水>sybr green>引物>模板
试一下吧
赞一下 回复此楼
8楼2013-03-22 12:08:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

phhcrab

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 桃之夭夭pFly at 2013-03-21 17:29:48
我是吸1ul加9ul的水，吸打混匀后再吸1ul到另一个pcr管中，加9ul水，如此重复做的~‘
是不是扩大成10ul加90ul的水这样稀释比较好？
你说的污染指的是哪一步怎么污染的呢？
谢谢你的回复~...

确实10ul加到90ul里会好很多的，混匀可以在涡旋振荡器上晃一下，然后离心。反复吹打会增加挂壁的，更何况才10ul。

未必是污染造成的，但是污染在哪一步都可能发生的。比如实验环境、移液器、枪头等等都可能存在污染的，如果你的样品体系很小的话，一点污染造成的影响可能就很大了。

做定量最好是用带滤芯的枪头，如果没这条件的话，那操作要更小心点。
赞一下 回复此楼
9楼2013-03-26 11:36:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

桃之夭夭pFly

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by phhcrab at 2013-03-26 11:36:40
确实10ul加到90ul里会好很多的，混匀可以在涡旋振荡器上晃一下，然后离心。反复吹打会增加挂壁的，更何况才10ul。

未必是污染造成的，但是污染在哪一步都可能发生的。比如实验环境、移液器、枪头等等都可能存在 ...

好的~谢谢了！近期发现是引物的退火温度的问题，提高到65°就好很多了~
赞一下 回复此楼
10楼2013-03-27 10:00:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 桃之夭夭pFly 的主题更新
111/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[博后之家] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +4 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 4/200 2026-09-29 19:27 by cqwQDCxMcL3I
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +4 ZYXdhzDAy9ZX 2026-09-28 4/200 2026-09-29 16:54 by yCO1Ll7aHtsw
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +4 ZYXdhzDAy9ZX 2026-09-28 4/200 2026-09-29 16:47 by yCO1Ll7aHtsw
[博后之家] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 ZYXdhzDAy9ZX 2026-09-28 3/150 2026-09-29 16:30 by etmYJ6d2rquH
[硕博家园] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 ZYXdhzDAy9ZX 2026-09-28 3/150 2026-09-29 16:03 by etmYJ6d2rquH
[论文投稿] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 tqUTOxClQUMF 2026-09-28 4/200 2026-09-29 15:15 by etmYJ6d2rquH
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 GDBe8tDZqE8z 2026-09-28 3/150 2026-09-29 14:30 by etmYJ6d2rquH
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 CfXuS1rDhLYN 2026-09-28 3/150 2026-09-29 14:24 by etmYJ6d2rquH
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +6 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 7/350 2026-09-29 14:07 by etmYJ6d2rquH
[博后之家] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 3/150 2026-09-29 13:56 by etmYJ6d2rquH
[教师之家] 某top大学教授说“能够在市场中兑现的能力才是真能力”无比同意！ +8 zju2000 2026-09-26 9/450 2026-09-29 13:47 by ahsoarli
[考研] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 tqUTOxClQUMF 2026-09-28 3/150 2026-09-29 09:59 by JzYBbHIXWSrW
[教师之家] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 GDBe8tDZqE8z 2026-09-28 4/200 2026-09-29 09:49 by JzYBbHIXWSrW
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 ZYXdhzDAy9ZX 2026-09-28 3/150 2026-09-29 06:42 by ZvyPK8n6Nfki
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 tqUTOxClQUMF 2026-09-28 3/150 2026-09-28 23:46 by b8fCuTHqckEt
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 CfXuS1rDhLYN 2026-09-28 4/200 2026-09-28 22:55 by ez6fGg9abYaj
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 4/200 2026-09-28 22:55 by ez6fGg9abYaj
[有机交流] 同一个分子，一条来自文献，一条来自AI——不告诉你答案，你会选哪条？ +3 tianxiaoxian 2026-09-28 6/300 2026-09-28 22:44 by tianxiaoxian
[找工作] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 5/250 2026-09-28 22:32 by ez6fGg9abYaj
[考博] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 6/300 2026-09-28 22:15 by ez6fGg9abYaj
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭