应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 实时荧光定量 相对定量 标准曲线的问题
111/2返回列表12下一页
查看: 3605  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

桃之夭夭pFly

新虫 (初入文坛)

[求助] 实时荧光定量 相对定量 标准曲线的问题

各位同仁：
    我最近做相对定量，首先做标准曲线看内参和目的基因的扩增效率是否一致，在这个环节上一直无法突破。
    问题是：我的cDNA以10倍梯度稀释了13个梯度，但是Ct值都很接近，都在19-21之间。我的体系是takela的，20ul
mix10
上0.4
下0.4
模板1
水8.2

95° 30s
95°5s
60°30s   40个循环

用的是96孔板，先把mix和上下，水混匀分装后，再加模板。
mix用之前先颠倒混匀。
加样时避免气泡的产生。

我的cDNA是由天根的反转录试剂盒得来的，用5ug的总RNA反转录成50ul的体系。

请各位帮我分析一下原因吧！做了3周了，一直这样无进展，很苦闷！谢谢您的分享和帮助了~
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-03-21 00:30:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

桃之夭夭pFly

新虫 (初入文坛)
求助啊求助！
回复此楼
2楼2013-03-21 12:53:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

phhcrab

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
桃之夭夭pFly: 金币+10 2013-03-21 17:31:58
你是10倍稀释的么？怎么会稀释了13个梯度，Ct都差不多呢？没稀释好吧，或者有污染。
赞一下 回复此楼
3楼2013-03-21 13:37:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bunnyxia

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-04-27 14:45:25
起始的ct值不高，可以用PCR产物试试。稀释梯度一般6、7个就行，可以5倍或10倍稀释。稀释时最好10ul稀释到100ul，而且要混匀，不要相互污染。
赞一下 回复此楼
4楼2013-03-21 17:09:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

桃之夭夭pFly

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by phhcrab at 2013-03-21 13:37:10
你是10倍稀释的么？怎么会稀释了13个梯度，Ct都差不多呢？没稀释好吧，或者有污染。

我是吸1ul加9ul的水，吸打混匀后再吸1ul到另一个pcr管中，加9ul水，如此重复做的~‘
是不是扩大成10ul加90ul的水这样稀释比较好？
你说的污染指的是哪一步怎么污染的呢？
谢谢你的回复~
赞一下 回复此楼
5楼2013-03-21 17:29:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

桃之夭夭pFly

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by bunnyxia at 2013-03-21 17:09:12
起始的ct值不高，可以用PCR产物试试。稀释梯度一般6、7个就行，可以5倍或10倍稀释。稀释时最好10ul稀释到100ul，而且要混匀，不要相互污染。

pcr产物？意思是用普通pcr扩增我的目的基因后，再作为模板稀释？
那我标准曲线这样得出，我做相对定量的时候也要这样吗》？
谢谢你的回复~
赞一下 回复此楼
6楼2013-03-21 17:31:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

我反正-信了

木虫 (小有名气)
我也一直在做这个，我用的也是TAKARA的，稀释的梯度没这么多，我是6个，外加三个重复和一个空白，也是10倍稀释，但是按10——100ul来稀释的反应条件中我40Cycies中有三步：95 5s，58  31s，72  30s：其他都差不多，试剂也一样！
赞一下 回复此楼
7楼2013-03-22 09:31:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhangqian082

新虫 (小有名气)
你提的RNA有没有去基因组污染呢
而且你做的时候改用八连管试一下，加样顺序：水>sybr green>引物>模板
试一下吧
赞一下 回复此楼
8楼2013-03-22 12:08:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

phhcrab

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 桃之夭夭pFly at 2013-03-21 17:29:48
我是吸1ul加9ul的水，吸打混匀后再吸1ul到另一个pcr管中，加9ul水，如此重复做的~‘
是不是扩大成10ul加90ul的水这样稀释比较好？
你说的污染指的是哪一步怎么污染的呢？
谢谢你的回复~...

确实10ul加到90ul里会好很多的，混匀可以在涡旋振荡器上晃一下，然后离心。反复吹打会增加挂壁的，更何况才10ul。

未必是污染造成的，但是污染在哪一步都可能发生的。比如实验环境、移液器、枪头等等都可能存在污染的，如果你的样品体系很小的话，一点污染造成的影响可能就很大了。

做定量最好是用带滤芯的枪头，如果没这条件的话，那操作要更小心点。
赞一下 回复此楼
9楼2013-03-26 11:36:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

桃之夭夭pFly

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by phhcrab at 2013-03-26 11:36:40
确实10ul加到90ul里会好很多的，混匀可以在涡旋振荡器上晃一下，然后离心。反复吹打会增加挂壁的，更何况才10ul。

未必是污染造成的，但是污染在哪一步都可能发生的。比如实验环境、移液器、枪头等等都可能存在 ...

好的~谢谢了！近期发现是引物的退火温度的问题，提高到65°就好很多了~
赞一下 回复此楼
10楼2013-03-27 10:00:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 桃之夭夭pFly 的主题更新
111/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +5 2rKfVQg2jQww 2026-11-06 9/450 2026-11-08 21:55 by l48hFd8Nwae2
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +5 2rKfVQg2jQww 2026-11-06 9/450 2026-11-08 21:55 by l48hFd8Nwae2
[论文投稿] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 6/300 2026-11-08 21:44 by l48hFd8Nwae2
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +5 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 8/400 2026-11-08 21:33 by l48hFd8Nwae2
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 9/450 2026-11-08 21:29 by l48hFd8Nwae2
[教师之家] 延安大学回应“副教授留绝笔信”：确已离世，正核实举报内容 +3 yexuqing 2026-11-04 5/250 2026-11-07 13:22 by 苏东坡二世
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +10 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 22/1100 2026-11-06 17:18 by 5sJFDKp2kwuI
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-05 7/350 2026-11-06 16:43 by 5sJFDKp2kwuI
[公派出国] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-05 5/250 2026-11-06 16:43 by 5sJFDKp2kwuI
[考博] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +6 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-05 8/400 2026-11-06 16:34 by 5sJFDKp2kwuI
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +6 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 14/700 2026-11-06 16:32 by 5sJFDKp2kwuI
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +6 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 12/600 2026-11-06 16:10 by 5sJFDKp2kwuI
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 11/550 2026-11-06 16:10 by 5sJFDKp2kwuI
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +7 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 14/700 2026-11-06 13:47 by BkA9Bi5cMhkD
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +8 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 14/700 2026-11-06 13:36 by BkA9Bi5cMhkD
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-05 10/500 2026-11-06 12:32 by BkA9Bi5cMhkD
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 12/600 2026-11-06 05:32 by qL1cU46YIdK0
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +4 kvewwGtKktqB 2026-11-04 11/550 2026-11-06 05:10 by qL1cU46YIdK0
[考博] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 7/350 2026-11-06 02:13 by qL1cU46YIdK0
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 10/500 2026-11-06 02:04 by qL1cU46YIdK0
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭